Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

Huden er den største organ i kroppen. Det skaber en barriere mellem det eksterne miljø og de indre organer. Desuden huden beskytter kroppen mod væsketab, miljømæssige påvirkninger, skader og infektioner og hjælper med at regulere kropstemperaturen ^1. På grund af sin udsatte beliggenhed, huden ofte påvirket af mekanisk, termisk eller kemisk traume. Selvom huden er generelt i stand til selv-reparation, kan flere lokale faktorer såsom infektion, iltning, og venøs tilstrækkelighed føre til forringet sårheling. Sårheling kan også blive forstyrret af systemiske faktorer som fedme, alkoholisme, rygning, medicin, ernæring og sygdomme som diabetes. ²

Processen af ​​sårheling kan opdeles i 3 faser: (i) den inflammatoriske fase, (ii) den proliferative og (iii) remodeling fase. Ved skade på huden, starter en kompleks signal-kaskade, der fører til lukning af såret. ³Efter skade, er såret blødning og en blodprop dannes. Fibroblaster flytte ind i blodprop og erstatte det med nyt væv, som efterfølgende ombygget i år.

Den nuværende forståelse af biologiske processer underliggende kutan reparation er begrænset. Små dyr og svin modeller er blevet anvendt til at undersøge sårheling. Men disse resultater kan ikke direkte overføres til mennesker på grund af artsspecifikke forskelle. Ud over disse in vivo modeller kan nogle aspekter af sårheling studeres ved at simulere et sår situationen via skrabe af in vitro monolagskulturer baseret på udødeliggjorte cellelinjer eller primære celler. ⁴ Disse skrabe modeller er meget standardiseret men ikke i tilstrækkelig grad afspejler kompleks in vivo fysiologi. ⁵ Udover to-dimensionelle modeller er blevet udviklet tredimensionale humane hudækvivalenter til dermatologisk forskning. Den dermale del af disse modeller er genereres ved hjælp af forskellige platforme, herunder decellulariseret dermis, ⁶ collagen hydrogeler, ^7,8 glycosaminoglycaner ⁹ eller syntetiske materialer. ¹⁰ Anvender disse hudækvivalenter, rolle epitel-mesenchymale interaktioner ^11, re-epitelialisering, den cellulære krydstale mellem fibroblaster og keratinocytter og påvirkning af forskellige vækstfaktorer kan studeres. Desuden er disse modeller er nyttige til at få ny viden om, hvordan fibroblaster vandre over i den sårede område, og hvordan kemotaktisk faktorer påvirker væv regenerering. ¹²

Ikke kun generation af sårheling selve modellen er udfordrende, men også at etablere en meget standardiseret sår i en model er problematisk. Almindelige teknikker til at skabe sår er scratch test, ¹³ brandsår, ¹⁴ tape slid, ¹⁵ termisk skade, ¹⁶ suge vabler, ¹⁷ flydende nitrogen, ¹⁸ lasere, ¹⁹ </sup> skalpeller, ¹⁸ meshers ⁶ og biopsi slag. ²⁰ De fleste af disse metoder har samme faldgruber. Skader, der gennemføres manuelt er vanskelige at standardisere og at reproducere mellem flere tests. Størrelse, form og dybde af såret variere mellem undersøgelser og dermed forringe kvaliteten af ​​forskning data. Brugen af ​​laser til definerede hud såret kan relativt let standardiseret men fører til en situation efterligne brandsår. Heat anvendes af laser kan forårsage proteindenaturering, blodplader aggregering eller fartøjer konstriktion, som kan føre til nekrotisk væv.

I en alternativ fremgangsmåde, vi har udviklet et automatiseret såret enhed (AWD), som giver os mulighed for at generere definerede og præcise kutane sår under sterile forhold. Sårede parametre, ligesom dybden og hastigheden af ​​penetration samt omdrejninger af borehovedet kan reguleres. I denne undersøgelse har vi kombineret den AWD med i hus udviklede fuld tykkelse hudækvivalenter (ftSE), som er sammenlignelig med en protokol offentliggjort af Gangatirkar et al. ⁸ dermale lag af huden ækvivalent er sammensat af humane dermale fibroblaster (HDF), der er indlejret i en collagen I hydrogel. På den dermale lag, humane epidermiskeratinocytter (HEK) er seedet. Inden for to uger ved luft-væske-grænsefladen HEK opbygge en epidermis består af flere vitale cellelag og stratum corneum. Udover generation af denne model, denne undersøgelse viser brugen af ​​AWD at skabe afgrænsede og præcise sår i FTSE.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen er designet til produktion af 24 fuld tykkelse hud ækvivalenter. Menneskelig dermale fibroblaster og epidermiskeratinocytter blev isoleret fra hudbiopsier ifølge en tidligere offentliggjort protokol. 21,22 Informeret samtykke blev opnået på forhånd, og undersøgelsen blev godkendt af institutionelle etiske komité på menneskers forskning af Julius-Maximilians-Universitetet Würzburg (afstemning 182 / 10). 1. Produktion af Dermal Component Opl?…

Representative Results

Det isolerede HDF og HEK adskiller både morfologi og i ekspression af typiske markører. HDF viste typiske spindel-form morfologi, mens morfologi HEK kan beskrives ved en brosten morfologi. Cellerne blev præget af immunhistokemisk farvning (figur 1), før du bruger dem til FTSE. HDF er positive for vimentin (figur 1A), en markør for fibroblaster. Primær HEK stærkt udtrykker tidlig differentiering protein cytokeratin-14 (figur 1B), men næsten ingen sent keratinocyt…

Discussion

In vitro-celler er normalt udvidet i todimensionale cellekulturer, hvor cellerne klæber til plastoverflader. Men disse dyrkningsbetingelser ikke afspejler de fysiologiske tredimensionale betingelser hvor celler vokser in vivo. Under tredimensionale forhold kan celler danner naturlige celle-celle og celle-matrix vedhæftede filer og migrere i tre dimensioner. Især i den kutane sårheling ligheden af in vivo situationen afgørende at generere meningsfulde data, som celle migration og matrix ge…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Skin model submers medium (500ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML