Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

De huid is het grootste orgaan van het lichaam. Het creëert een barrière tussen de externe omgeving en de interne organen. Bovendien is de huid beschermt het lichaam tegen vochtverlies, milieu-invloeden, verwondingen en infecties en helpt om de lichaamstemperatuur ¹ reguleren. Door zijn open ligging, wordt de huid vaak beïnvloed door mechanische, thermische of chemische trauma. Hoewel de huid is over het algemeen in staat zichzelf te repareren, kan meerdere lokale factoren zoals infectie, zuurstof, en veneuze toereikendheid leiden tot verstoorde wondgenezing. Wondgenezing kan worden gestoord door systemische factoren zoals obesitas, alcoholisme, roken, medicatie, voeding en ziekten zoals diabetes. ²

Het proces van wondgenezing kan worden verdeeld in 3 fasen: (i) de ontstekingsfase, (ii) de proliferatieve en (iii) remodelleringsfase. Bij schade aan de huid, een complex signaal cascade begint, waardoor de sluiting van de wond. ³Na een blessure, wordt de wond bloeden en een bloedstolsel wordt gevormd. Fibroblasten verhuizen naar het bloedstolsel en vervang het door nieuw weefsel dat vervolgens wordt verbouwd door de jaren heen.

Het huidige begrip van de biologische processen onderliggende huid herstel beperkt. Kleine dieren en varken modellen zijn gebruikt om wondgenezing te bestuderen. Echter, deze resultaten niet direct worden overgedragen op de mens als gevolg van species-specifieke verschillen. Naast deze in vivo modellen, kunnen bepaalde aspecten van wondgenezing worden bestudeerd door een gewikkelde toestand gesimuleerd door krassen in vitro monolaag kweken gebaseerd op geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen. ⁴ Deze krassen modellen zijn zeer gestandaardiseerd, maar onvoldoende weerspiegelen de in vivo fysiologie. ⁵ Naast tweedimensionale modellen, zijn driedimensionale humane huid equivalenten ontwikkeld voor dermatologisch onderzoek. De dermale deel van deze modellen zijn gevergoede met behulp van diverse steigers inclusief gedecellulariseerde dermis, ⁶ collageen hydrogels, ^7,8 glycosaminoglycanen ⁹ of synthetische materialen. ¹⁰ Gebruikmakend van deze huid equivalenten, de rol van epitheliale-mesenchymale interacties ^11, de re-epithelialisatie, de cellulaire overspraak tussen fibroblasten en keratinocyten en de invloed van verschillende groeifactoren kunnen worden bestudeerd. Bovendien zijn deze modellen zijn nuttig om nieuwe kennis over hoe fibroblasten migreren naar de gewonde gebied en hoe chemotactische factoren beïnvloeden weefselregeneratie te krijgen. ¹²

Niet alleen genereren van de wondgenezing model zelf is uitdagend, maar ook om vast te stellen een zeer gestandaardiseerde wond model problematisch. Gebruikte technieken om te creëren wonden zijn krastesten, ¹³ brandwonden, ¹⁴ tape slijtage, ¹⁵ thermisch letsel, ¹⁶ zuig blaren, ¹⁷ vloeibare stikstof, ¹⁸ lasers, ¹⁹ </sup> scalpels, ¹⁸ meshers ⁶ en biopsie stoten. ²⁰ De meeste van deze methoden hebben dezelfde valkuilen. Blessures handmatig geïmplementeerd zijn moeilijk te standaardiseren en te reproduceren tussen meerdere tests. Grootte, vorm en diepte van de wond variëren tussen de studies en daarmee afbreuk doen aan de kwaliteit van de onderzoeksgegevens. Het gebruik van laser voor gedefinieerde huid verwonden kan relatief eenvoudig worden gestandaardiseerd, maar leidt tot een situatie nabootsen van brandwonden. Heat van laser toegepast kan eiwitdenaturatie, bloedplaatjes aggregatie of vaartuigen vernauwing, wat kan leiden tot necrotisch weefsel.

In een alternatieve benadering, een geautomatiseerde verwonding apparaat (AWD), die ons in staat stelt om te definiëren en de huidwonden onder steriele omstandigheden te genereren ontwikkelden we. Verwonding parameters, zoals diepte en snelheid van penetratie en toerental van de boorkop kan worden geregeld. In deze studie hebben we gecombineerd de AWD met in eigen huis ontwikkelde volledige dikte van de huid equivalenten (ftSE) die vergelijkbaar zijn met een protocol gepubliceerd door Gangatirkar et al. ⁸ de dermale laag van de huid equivalent uit humane dermale fibroblasten (HDF), die zijn ingebed in een collageen I hydrogel. Op de huid laag, humane epidermale keratinocyten (HEK) zijn gezaaid. Binnen twee weken aan de lucht-vloeistof-interface van de HEK opbouwen van een epidermis bestaat uit meerdere vitale cel lagen en een hoornlaag. Naast de generatie van dit model, deze studie toont het gebruik van de AWD te definiëren en de wonden te creëren in de FTSE.

Protocol

OPMERKING: Het protocol is ontworpen voor de productie van 24 volledige dikte huid equivalenten. Humane dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten werden geïsoleerd uit huidbiopsies volgens een eerder gepubliceerde protocol. 21,22 Informed consent werd vooraf verkregen en de studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie op de menselijke onderzoek van het Julius-Maximilians-Universität Würzburg (182 stemmen / 10). 1. De productie van Dermal Component …

Representative Results

De geïsoleerde HDF en HEK verschillen zowel in morfologie en in de expressie van de typische markers. De HDF toonde typische spindel-vormige morfologie, terwijl de morfologie van Hek kan worden beschreven door een geplaveide morfologie. De cellen werden gekarakteriseerd door immunohistochemische kleuring (figuur 1) alvorens ze voor FTSE. De HDF zijn positief voor vimentine (figuur 1A), een marker voor fibroblasten. Primaire HEK zeer uiten vroege differentiatie eiwit cytokeratine-14 <st…

Discussion

In vitro cellen gewoonlijk uitgebreid tweedimensionale celculturen, waarbij cellen hechten aan kunststof oppervlakken. Echter, deze kweekomstandigheden niet de fysiologische driedimensionale omstandigheden waarbij cellen groeien in vivo. Onder driedimensionale omstandigheden kunnen cellen natuurlijke cel-cel en cel-matrix aanhangsels samen en migreren in drie dimensies. Vooral in de cutane wondgenezing de gelijkenis van de in vivo situatie is cruciaal om zinvolle gegevens te genereren, zoals c…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Skin model submers medium (500ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML