Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

Huden är det största organ i kroppen. Den skapar en barriär mellan den yttre miljön och de inre organen. Dessutom skyddar huden kroppen från vätskeförlust, miljöpåverkan, skador och infektioner och hjälper till att reglera kroppstemperaturen ^1. På grund av dess utsatta läge, huden påverkas ofta av mekanisk, termisk eller kemisk trauma. Även huden vanligen kan självreparation, kan flera lokala faktorer såsom infektion, syresättning och venös tillräcklighet leda till försämrad sårläkning. Sårläkning kan också störas av systemiska faktorer som fetma, alkoholism, rökning, medicinering, kost och sjukdomar som diabetes. ²

Processen för sårläkning kan delas in i tre faser: (i) den inflammatoriska fasen, (ii) den proliferativa och (iii) remodellering fas. Vid skada på huden, startar en komplex signal-kaskad, vilket leder till nedläggning av såret. ³Efter skada såret blödning och en blodpropp bildas. Fibroblaster flyttar in i blodpropp och ersätta det med ny vävnad som därefter ombyggd under åren.

Den nuvarande förståelse av biologiska processer underliggande kutan reparation är begränsad. Små djur och gris modeller har använts för att studera sårläkning. Dessa resultat kan inte direkt överföras till människor på grund av artspecifika skillnader. Förutom dessa in vivo-modeller, kan vissa aspekter av sårläkning studeras genom att simulera en lindad situation genom repning av monoskikt in vitro kulturer baserat på odödliggjorda cellinjer eller primära celler. ⁴ Dessa skrapar modeller är mycket standardiserad men återspeglar inte tillräckligt den komplex in vivo fysiologi. ⁵ Förutom tvådimensionella modeller, har tredimensionella humana hudekvivalenter utvecklats för dermatologisk forskning. Den dermala delen av dessa modeller är GEnerated med olika ställningar inklusive decellulariserade dermis, ⁶ kollagen hydrogel, ^7,8 glykosaminoglykaner ⁹ eller syntetiska material. ¹⁰ Anställa dessa hudekvivalenter, roll epiteliala-mesenkymala interaktioner ^11, återpitelise, cell överhörning mellan fibroblaster och keratinocyter och kan studeras inverkan av olika tillväxtfaktorer. Dessutom är dessa modeller är användbara för att vinna ny kunskap om hur fibroblaster vandrar in de sårade området och hur kemotaktisk faktorer påverkar vävnadsregenerering. ¹²

Inte bara generationen av sårläkning modellen i sig är en utmaning, men också för att skapa en mycket standardiserad sår i en modell är problematiskt. Vanliga tekniker för att skapa sår är skraptest, ¹³ brännskador, ¹⁴ band nötning, ¹⁵ termisk skada, ¹⁶ sug blåsor, ¹⁷ flytande kväve, ¹⁸ lasrar, ¹⁹ </sup> skalpeller, ¹⁸ meshers ⁶ och biopsi stansar. ²⁰ De flesta av dessa metoder har samma fallgropar. Skador förs manuellt är svåra att standardisera och att reproducera mellan flera tester. Storlek, form och djup såret varierar mellan studier och därmed försämra kvaliteten på forskningsdata. Användningen av laser för definierad hud sårskada kan relativt enkelt standardiseras men leder till en situation härma brännsår. Värme tillämpas av laser kan orsaka proteindenaturering, trombocyter aggregering eller kärl sammandragning, vilket kan leda till nekrotisk vävnad.

I ett alternativt synsätt, utvecklade vi en automatiserad såra anordning (AWD), vilket ger oss möjlighet att skapa definierade och precisa kutana sår under sterila förhållanden. Såra parametrar, såsom djup och hastighet penetration samt varv av borrhuvudet kan regleras. I denna studie, vi kombinerat AWD med i egenutvecklade full tjocklek hudekvivalenter (ftSE) som är jämförbar med ett protokoll som publicerats av Gangatirkar et al. ⁸ Den dermala lagret av huden motsvarande består av humana dermala fibroblaster (HDF), vilka är inbäddade i en kollagen I hydrogel. På huden lagret, humana epidermala keratinocyter (HEK) är seedade. Inom två veckor på luft-vätskegränssnittet Hek bygga upp en epidermis består av flera vitala cellager och en hornlagret. Förutom generationen av denna modell, visar denna studie att använda AWD att skapa definierade och exakta sår i FTSE.

Protocol

OBS: Protokollet är utformat för produktion av 24 fulla tjocklek hudekvivalenter. Mänsklig dermala fibroblaster och epidermala keratinocyter isolerades från hudbiopsier enligt ett tidigare publicerat protokoll. 21,22 Informerat samtycke erhölls förväg och studien godkändes av institutionella etiska kommittén på människors forskning av Julius-Maximilians-University Würzburg (rösta 182 / 10). 1. Produktion av Dermal Component Lös kollagen med 0,1% ättiksyra…

Representative Results

Det isolerade HDF och Hek skiljer både i morfologi och i uttryck av typiska markörer. HDF visade typiska spindelform morfologi, medan morfologi Hek kan beskrivas med en gatsten morfologi. Cellerna karaktäriserades av immunhistokemisk färgning (Figur 1) innan du använder dem för FTSE. HDF är positiva för vimentin (Figur 1A), en markör för fibroblaster. Primär Hek uttrycker mycket tidig differentiering protein cytokeratin-14 (Figur 1B) men nästan ingen sen ker…

Discussion

In vitro celler vanligen expanderas i tvådimensionella cellkulturer, i vilka celler vidhäftar till plastytor. Men dessa odlingsbetingelser inte speglar de fysiologiska tre-dimensionella förhållanden i vilka celler växer in vivo. Under tredimensionella förhållanden, kan cellerna bildar naturliga cell-cell och cell-matrix bilagor och migrera i tre dimensioner. Särskilt i kutan sårläkning likheten av situationen in vivo är avgörande för att skapa meningsfulla uppgifter, som cellmigra…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Skin model submers medium (500ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML