Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.
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Methodenartikel
Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zwei-Photonen-Mikroskopie (2P) wird verwendet, um zelluläre Dynamiken und Wechselwirkungen tief im lebenden, intakten Gewebe aufzudecken. Hier stellen wir eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen im murinen Rückenmark vor. Diese Technik eignet sich hervorragend zur Analyse der Dynamik von neuralen Vorläuferzellen (NPC) nach der Transplantation in Rückenmark bei neuroinflammatorischen demyelinisierenden Erkrankungen. NPCs wandern zu Stellen axonaler Schädigung, vermehren sich, differenzieren sich zu Oligodendrozyten und nehmen an der direkten Remyelinisierung teil. NPCs sind damit eine vielversprechende therapeutische Behandlung zur Linderung chronischer demyelinisierender Erkrankungen. Da transplantierte NPCs in die geschädigten Bereiche auf der ventralen Seite des Rückenmarks wandern, ist eine traditionelle intravitale 2P-Bildgebung unmöglich, und bisher waren mit histochemischen Färbeansätzen nur Informationen über statische Wechselwirkungen verfügbar. Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um transplantierte NPCs im ventralen Rückenmark abzubilden, kann sie auf zahlreiche Studien an transplantierten und endogenen Zellen im gesamten Rückenmark angewendet werden. In diesem Artikel demonstrieren wir die Präparation und Bildgebung eines Rückenmarks mit verstärkten gelb fluoreszierenden Protein-exprimierenden Axonen und verstärkten grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden transplantierten NPCs.
Einleitung
Mausmodelle der Demyelinisierung, einschließlich experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und intrakranielle Infektion mit neuroadapted Maus-Hepatitis-Virus (MHV), sind ausgezeichnete Werkzeuge zur molekularen Signalwege und zellulären Interaktionen mit der Krankheit zu studieren. Sie haben dazu geführt, und unterstützt die Wirksamkeit der FDA zugelassenen pharmazeutischen Therapien, die sich vornehmlich an Einstellung der Autoimmun- und Entzündungs 1. Sobald jedoch endogenen Remyelinisierung ausgefallen ist, die gegenwärtig zugelassenen Therapien nicht wirksam beheben demyelinisierten Läsionen im zentralen Nervensystem. Daher sind die Reparat....
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Protokoll
HINWEIS: Ethics Statement: Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of California, Irvine, Protokoll # 2010-2943 genehmigt.
1. Entfernen des Rückenmarks
- Zeigen Papierhandtücher mit ~ 100% Flüssigkeit Isofluran USP benetzt in euthanizing Kammer und legen trockenen Papierhandtücher auf. Zeigen Maus in Kammer auf der Oberseite des trockenen Papiertüchern so Maus die Isofluran nicht berühren, und sicherstellen, dass die Kammer bedeckt. Frühestens nach einer Minute nach dem Atemstillstand zu gewährleisten, dass die Maus euthanasiert.
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Ergebnisse
Während die explantiert Rückenmark Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden, um jede Fluoreszenz innerhalb des Rückenmarks zu visualisieren, unser Vertreter Ergebnisse zeigen eGFP-NPC-Interaktionen mit eYFP-Axone. Zunächst zeigen wir die eingebetteten ventralen Rückenmark Zubereitung in 1A. Als nächstes zeigen wir die 2P Mikroskopaufbau und Schlüsselkomponenten in der 1B, Fig. 2 zeigt eGFP und eYFP Fluoreszenz in einem Z-Stapel innerhalb des ventralen Rückenmark. Erwerb von aufe.......
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Diskussion
Echtzeit-2P Bildgebung von intaktem Gewebe ist erforderlich, um NPC Kinetik und Interaktionen nach der Transplantation in die demyelinisierten Maus Rückenmark zu untersuchen. Intravital Imaging-2P wird häufig verwendet, um zelluläre Dynamik auf der Rückenseite des Rückenmarks in lebenden Mäusen zu bestimmen und wurde genutzt, um Rücken Demyelinisierung in demyelinisierende Erkrankung 17-19 studieren. Da transplantierte NPCs wandern zur ventralen weißen Substanz, die zu tief, um Bild in situ mit 2P-Mikroskopie.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (an M.D.C.), R39 GM-048071 (an I.P.) und R01 NS-074987 (an T.E.L.) und den National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (an C.M.W., T.E.L. und M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (an M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (an J.G.W.) und Finanzierung durch die George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Isofluran, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Feine Schere | Fine Science Tools | 14060-09 | scharfe |
| Skalpellklinge #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Skalpellgriff | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe Pinzette | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas Schere | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| Skalpellklinge #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| Agarose, niedrige Geliertemperatur | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (Tissue-Klebstoff) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm quadratischer Deckschirm | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X Tauchobjektiv, 1,1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm einschneidiger dichroitischer Strahlteiler | Semrock FF520-Di02-25x36 | Brightline | |
| 560 nm dichroitischer Strahlteiler mit einer Kante | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| Photomultiplier-Röhren | Hamamatsu | R928 | |
| C/L Schlauchpumpe mit variabler Drehzahl | Masterflex | 77122-22 | |
| digitales Thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Saphir Laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 Software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 Software | Bitplane | N/A |
Referenzen
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
