Visualización de<em> Streptococcus pneumoniae</em> Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior
Summary
Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Abstract
Durante bacteriemia Streptococcus pneumoniae puede trasladar a través del endotelio vascular en el miocardio y formar bacterias llenos discretas lesiones microscópicas (microlesiones) que son notable debido a la ausencia de la infiltración de células inmunes. Debido a su liberación de productos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesiones se cree que contribuyen a la insuficiencia cardíaca que se observa con frecuencia durante la enfermedad neumocócica invasiva fulminante en adultos. En esto se demuestra un protocolo para la infección experimental de ratón que lleva a la formación reproducible microlesión cardíaco dentro de 30 horas. La instrucción es proporcionada en la identificación microlesión en hematoxilina y eosina secciones de corazón de colores y las distinciones morfológicas entre microlesiones principios y finales se destacan. La instrucción es proporcionada en un protocolo para la verificación de S. pneumoniae dentro microlesiones utilizando anticuerpos contra el polisacárido capsular de neumococo ymicroscopía de inmunofluorescencia. Por último, se proporciona un protocolo de intervención antibiótico que rescata los ratones infectados y para la detección y evaluación de la formación de cicatrices en los corazones de los ratones convalecientes. Juntos, estos protocolos facilitar la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la invasión cardiaca neumocócica, muerte de los cardiomiocitos, la remodelación cardiaca como resultado de la exposición a S. pneumoniae, y la respuesta inmune a los neumococos en el corazón.
Introduction
La hospitalización de adultos para la neumonía adquirida en la comunidad (NAC) conlleva un riesgo documentado de eventos cardiacos adversos que contribuyen a la mortalidad 1-4. En un estudio reciente de Corrales-Medina et al. Se encontraron complicaciones cardíacas que se asocia con y / o responsable del 27% de las muertes por neumonía asociada a 3. Streptococcus pneumoniae (neumococo), la causa más común de la PAC y la sepsis 5, se ha asociado directamente con eventos cardíacos adversos en hasta el 19% de los pacientes adultos ingresados 6. Eventos cardíacos adversos asociados con la neumonía son la insuficiencia nuevo o empeorado cardíaca congestiva, arritmias, infarto de miocardio y en orden decreciente de frecuencia 6.
En un reciente artículo de PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae se encontró que era capaz de traslocación a través del endotelio vascular cardíaco, la entrada en el myocardium, y la formación de lesiones microscópicas no purulentas discretas (microlesiones) llenos de bacterias en los ventrículos durante la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) 7. Se observó evidencia de formación microlesión cardiaca en muestras cardíacas de los primates no humanos y personas que habían sucumbido a la infección neumocócica. Asimismo, los ratones infectados experimentalmente desarrollaron de manera reproducible microlesiones cardíacas. En los ratones, el tamaño y el número microlesión se correlacionó positivamente con la duración y la gravedad de la bacteriemia, los niveles de troponina cardíaca en el suero, y la electrofisiología cardiaca aberrante. La translocación bacteriana en el corazón se encontró que se produzca a través de los mismos mecanismos responsables de la translocación del neumococo través de la barrera sangre-cerebro y el desarrollo de la meningitis neumocócica, es decir, la proteína de unión a colina-A mediada por invasión de células endoteliales vasculares en un receptor de laminina y de plaquetas receptor del factor de -activating manera dependiente de 8. Microlesformación de iones también requiere la neumolisina neumocócica toxina formadora de poros que se encontró para matar a los cardiomiocitos 7.
Microlesiones cardíacos neumocócicas son distintos del purulenta de partes blandas y abscesos cardíacas que son causadas por otras bacterias Gram-positivas, incluido el Staphylococcus aureus. Estos se caracterizan por una sola focos de bacterias rodeadas por los neutrófilos y 9,10 deposición de fibrina. Microlesiones formado por S. pneumoniae son de menor tamaño, distribuidos a lo largo de un corazón afectado, y carecen de infiltrados de células inmunes. Durante las primeras etapas de la infección, microlesiones causadas por S. pneumoniae aparecen como áreas de tejido dañado o inflamado evocador de las muestras patológicas de la cardiomiopatía. Algunos monocitos se pueden observar durante este tiempo, sin embargo, su presencia es de corta duración y las lesiones se convierten rápidamente necrótico en apariencia y llena de bacterias, mientras que al mismo tiempo continuar a GRujo de tamaño hasta la muerte del animal o la intervención antimicrobiana. Es importante destacar que, en el plazo de 3 días de la intervención a los antibióticos, profusa infiltración de células inmunes se observa en el antiguo sitio de la lesión y esto va acompañado de robusto depósito de colágeno. La remodelación cardiaca similar se ha reportado que ocurre después de un infarto junto con consecuencias duraderas sobre la función cardíaca 11-15. Por lo tanto, microlesiones son una posible explicación para los eventos cardíacos adversos que ocurren durante el IPD y, posiblemente, el aumento de la incidencia de la mortalidad relacionada con el corazón en personas convalecientes que han sobrevivido al episodio de la enfermedad.
En este documento, se proporciona la instrucción en el modelo experimental de ratón de IPD y formación de la lesión cardiaca y la visualización de microlesiones cardíacos en las primeras y últimas etapas de la infección. El protocolo para la detección de la deposición de colágeno en los animales que han sido salvados por la intervención antimicrobiana se demuestra. El objetivo de este artículo es facilitar la investigación de otros investigadores sobre este importante y novedoso patología neumocócica.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe, un método altamente reproducible para inducir S. pneumoniae mediada microlesiones cardíacas en ratones durante IPD y las técnicas para su visualización se demuestra. Los ratones se infectan con una dosis de bacterias que supera el umbral del sistema inmune para el despacho, dando lugar a bacteremia de alto grado, similar a la que ocurre durante la sepsis humana, y conduce a la translocación bacteriana eventual en el miocardio. Por razones aún desconocidas, S. pneumoniae en el cor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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