Visualisering af<em> Streptococcus pneumoniae</em> Inden Hjerte småsår og efterfølgende Cardiac Remodeling

Summary

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Abstract

Under bakteriæmi kan Streptococcus pneumoniae translokerer over det vaskulære endotel i myocardium og danne diskrete bakterier fyldt mikroskopiske læsioner (småsår), der er bemærkelsesværdige på grund af fraværet af infiltrerende immunceller. På grund af deres udslip af kardiotoksiske produkter, S. pneumoniae inden småsår menes at bidrage til hjertesvigt, der ofte observeres under rase invasiv pneumokoksygdom hos voksne. Heri påvises en protokol for eksperimentel mus infektion, der fører til reproducerbar hjerte- mikrolæsion dannelse inden for 30 timer. Undervisningen tilbydes på mikrolæsion identifikation i hematoxylin & eosin farvede hjerte sektioner og de morfologiske forskelle mellem tidlige og sene småsår er fremhævet. Undervisningen tilbydes på en protokol til verifikation af S. pneumoniae inden småsår anvendelse af antistoffer mod pneumokok kapselpolysaccharid ogimmunofluorescens-mikroskopi. Endelig er en protokol for antibiotisk indgreb, der redder inficerede mus og til påvisning og vurdering af ardannelse i hjerterne på rekreationshjem mus forudsat. Tilsammen vil disse protokoller lette efterforskningen af de molekylære mekanismer bag pneumokok hjerte- invasion, cardiomyocyte død, hjerte remodellering som følge af eksponering for S. pneumoniae, og immunresponset på pneumokokker i hjertet.

Introduction

Indlæggelse af voksne til community-erhvervet pneumoni (CAP) bærer en dokumenteret risiko for uønskede hjertetilfælde, der bidrager til dødeligheden ^1-4. I en nylig undersøgelse fra Corrales-Medina et al. Hjertekomplikationer viste sig at være forbundet med og / eller er ansvarlige for 27% af lungebetændelse-associerede dødsfald ^3. Streptococcus pneumoniae (den pneumokokker), den mest almindelige årsag til den fælles landbrugspolitik og sepsis ^5, har været direkte forbundet med uønskede hjertetilfælde hos så mange som 19% af optaget voksne patienter ^6. Utilsigtede hjertetilfælde forbundet med lungebetændelse omfatte ny eller forværret hjerteinsufficiens, arytmier og myokardieinfarkt efter faldende frekvens ^6.

I en nylig PLoS Patogener artikel af Brown et al., Blev S. pneumoniae fundet at være i stand til translokation gennem hjertets vaskulære endotel, indtræden i myocardium, og dannelse af diskrete ikke-purulent mikroskopiske læsioner (småsår) fyldt med bakterier i hjertekamrene under invasiv pneumokoksygdom (IPS) ^7. Dokumentation af hjerte mikrolæsion dannelse blev observeret i hjerte-prøver fra ikke-menneskelige primater og enkeltpersoner, der var bukket under for pneumokok-infektion. Ligeledes eksperimentelt inficerede mus reproducerbart udviklet kardiale småsår. Hos mus var mikrolæsion størrelse og antal positivt korreleret med varigheden og sværhedsgraden af ​​bakteriæmi, niveauer af kardial troponin i sera, og afvigende hjerteelektrofysiologi. Bakteriel translokation ind i hjertet blev fundet at ske via de samme mekanismer, der er ansvarlige for translokation af pneumokok over blod-hjerne-barrieren og udvikling af pneumokok-meningitis, dvs., cholin-bindende protein A-medieret invasion af vaskulære endotelceller i en laminin receptor og Blodplade -activating faktor receptor afhængig måde ^8. Microlesiondannelse kræves også pneumokok poredannende toksin pneumolysin, der blev fundet at dræbe cardiomyocytter ^7.

Pneumokok kardiale småsår er adskilt fra purulent blødt væv og hjerte abscesser, der er forårsaget af andre Gram-positive bakterier, herunder Staphylococcus aureus. Disse er kendetegnet ved en enkelt foci af bakterier omgivet af neutrofiler og fibrinaflejring ^9,10. Småsår dannet af S. pneumoniae er mindre i størrelse, fordelt i en berørt hjerte og mangler immune celleinfiltrater. I de tidlige stadier af infektion, småsår forårsaget af S. pneumoniae fremstå som områder med beskadiget eller betændt væv, der minder om de patologiske tegn på kardiomyopati. Nogle monocytter kan observeres i løbet af denne tid, men deres tilstedeværelse er kortvarig og læsioner hurtigt blive nekrotiske i udseende og fyldt med bakterier og samtidig fortsætte med at grow i størrelse, indtil dyrets død eller antimikrobielle intervention. Vigtigere er det, inden for 3 dage antibiotika indgriben, er rigelig immun celle infiltration observeret ved den tidligere læsion websted, og dette er ledsaget af robust kollagenaflejring. Lignende hjerte-remodellering er blevet rapporteret at forekomme efter infarkt sammen med varige konsekvenser for hjertefunktionen ^11-15. Således småsår er en potentiel forklaring på de negative kardiale hændelser, der opstår i løbet af IPD og eventuelt øget forekomst af hjerte-dødelighed i rekonvalescente personer, der har overlevet sygdommen episode.

Heri er undervisning, som gives på den eksperimentelle musemodel af IPD og hjerte-læsion dannelse og visualisering af hjerte-småsår på tidlige og sene stadier af infektionen. Protokollen til påvisning af kollagenaflejring hos dyr, der er blevet reddet af antimikrobielle indgriben demonstreres. Målet med denne artikel er at facilitate forskningen af ​​andre forskere på dette vigtige og nye pneumokok patologi.

Protocol

BEMÆRK: Alle mus forsøg blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg ved The University of Texas Health Science Center på San Antonio (protokol # 13032-34-01C). Animal pleje og forsøgsprotokoller overholdes Public Law 89-544 (Animal Welfare Act) og ændringer, sundhedstjenester retningslinjer, og vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (US Department of Health & Human Services). 1. Infektion Opnå BALB / c-mus af begge køn i alderen 1…

Representative Results

Visualisering af småsår af H & E Hjerte småsår blev observeret i hjertekamrene af H & E-farvede hjerte-afsnit fra mus med IPD efter deres IP udfordring med TIGR4. Figur 1 viser stigningen i størrelsen af disse læsioner mellem 24 og 30 timer efter infektion (HPI), med større antal hematoxylin -stained (dvs. lilla-blå) pneumokokker synlig i læsionen. Småsår blev karakteriseret ved en vacuole-lignende morfologi, tættere eosin (rød) farvnin…

Discussion

I denne rapport, at en meget reproducerbar metode fremkalde S. pneumoniae medieret hjerte- småsår i mus under IPD og teknikker til deres visualisering demonstreres. Mus inficeret med en dosis af bakterier, der overgår immunsystemets tærskel for clearance, hvilket fører til høj kvalitet bakteriæmi svarende til den, der forekommer i løbet af human sepsis og fører til eventuel bakteriel translokation i myokardiet. Af endnu ukendte årsager, S. pneumoniae i hjertet er i stand til at replikere ufor…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Todd-Hewitt broth	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normal Goat Serum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumococcus antiserum	Statens Serum Institut	16747
goat anti-rabbit FITC conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
phosphomolybdic acid 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0.1% Sirius Red in picric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0.01 N hydrochloric acid	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscope Slides	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	unspeciified		Standard