Visualisering av<em> Streptococcus pneumoniae</em> Inom Cardiac små sår och efterföljande hjärt ombyggnad
Summary
Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Abstract
Under bakteriemi Streptococcus pneumoniae kan translokera över kärlendotelet i hjärtmuskeln och bildar diskreta bakteriefyllda mikroskopiska lesioner (små sår) som är anmärkningsvärt på grund av frånvaron av infiltrerande immunceller. På grund av deras frigivning av kardiotoxiska produkter, S. pneumoniae inom små sår tros bidra till hjärtsvikt som ofta observeras under DUNDRA invasiv pneumokocksjukdom hos vuxna. Häri demonstreras ett protokoll för experimentell mus infektion som leder till reproducerbara hjärt microlesion bildning inom 30 timmar. Undervisningen ges på microlesion identifiering i hematoxylin & eosin färgade hjärtsektioner och de morfologiska skillnaderna mellan tidiga och sena små sår är markerade. Undervisningen ges på ett protokoll för verifiering av S. pneumoniae inom små sår med hjälp av antikroppar mot pneumokock kapselpolysackarid ochimmunfluorescensmikroskopi. Sist är ett protokoll för antibiotika ingripande som räddar infekterade möss och för kartläggning och bedömning av ärrbildning i hjärtat på konvalescent möss tillhandahålls. Tillsammans kommer dessa protokoll lätta utredningen av de molekylära mekanismerna bakom pneumokocker hjärt invasion, cardiomyocyte död, hjärt ombyggnad till följd av exponering för S. pneumoniae, och immunsvaret på pneumokocker i hjärtat.
Introduction
Sjukhusvistelse för vuxna för samhällsförvärvad pneumoni (CAP) bär en dokumenterad risk för skadliga hjärthändelser som bidrar till dödligheten 1-4. I en färsk undersökning från Corrales-Medina et al. Hjärtkomplikationer befanns vara associerad med och / eller svarar för 27% av lunginflammation associerade dödsfallen 3. Streptococcus pneumoniae (pneumokocker), den vanligaste orsaken till CAP och sepsis 5, har direkt samband med ogynnsamma hjärthändelser i så många som 19% av upptagna vuxna patienter 6. Negativa hjärt händelser i samband med lunginflammation inkluderar nya eller förvärrats hjärtsvikt, arytmier och hjärtinfarkt i fallande frekvens 6.
I en nyligen PLoS Pathogens artikel av Brown et al., S. pneumoniae befanns vara i stånd att translokering genom hjärt kärlendotel, inträde i myocardium, och bildandet av diskreta icke variga mikroskopiska lesioner (små sår) fyllda med bakterier i kamrarna under invasiv pneumokocksjukdom (IPS) 7. Bevis på hjärt microlesion bildning observerades i hjärtprover från icke-mänskliga primater och individer som hade gett efter för pneumokockinfektion. Likaså experimentellt infekterade möss reproducerbart utvecklat hjärt små sår. Hos möss var microlesion storlek och antal positivt korrelerad med varaktighet och svårighetsgrad av bakteriemi, nivåer av kardiellt troponin i serum, och avvikande hjärtats elektrofysiologi. Bakteriell translokation in i hjärtat befanns inträffa genom samma mekanismer som ansvarar för translokation av pneumokock över blod-hjärnbarriären och utveckling av pneumokockmeningit, dvs, kolinbindande protein A förmedlad invasion av vaskulära endotelceller i en Lamininreceptor och Platelet aktiverande faktor-receptorberoende sätt 8. Microlesion formation krävs också pneumokock porbildande toxin pneumolysin som hittades döda cardiomyocytes 7.
Pneumococcal hjärt små sår är distinkta från purulent mjukvävnad och hjärt abscesser som orsakas av andra grampositiva bakterier inklusive Staphylococcus aureus. Dessa kännetecknas av en enda härdar av bakterier omgivna av neutrofiler och fibrinavsättning 9,10. Små sår som bildas av S. pneumoniae är mindre i storlek, fördelade över en drabbad hjärta, och saknar immun cellinfiltrat. Under de tidiga stadierna av infektion, små sår orsakad av S. pneumoniae visas som områden med skadad eller inflammerad vävnad som påminner om de patologiska tecken på kardiomyopati. Vissa monocyter kan observeras under denna tid, men deras närvaro är kortlivad och lesioner snabbt blivit nekrotisk i utseende och fylld med bakterier samtidigt fortsätter att grow i storlek tills djurets död eller antimikrobiell ingripande. Viktigt inom 3 dagar av antibiotika ingripande, är ymnig immuncellinfiltration observerades vid den förra lesionsstället och detta åtföljs av robust kollagenavsättning. Liknande hjärt ombyggnad har rapporterats förekomma efter infarkt tillsammans med bestående konsekvenser för hjärtfunktion 11-15. Således små sår är en potentiell förklaring till de negativa hjärthändelser som inträffar under IPD och möjligen den ökade förekomsten av hjärtrelaterade dödligheten i konvalescent individer som har överlevt sjukdomen episoden.
Häri finns instruktioner ges på den experimentella musmodell av IPD och hjärt lesionsbildning och visualisering av hjärt små sår på tidiga och sena stadier av infektion. Protokollet för detektion av kollagen nedfall hos djur som har räddats av antimikrobiell ingripande demonstreras. Målet med denna artikel är att facilitate forskning av andra utredare på denna viktiga och nya pneumokock patologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport, att en mycket reproducerbar metod inducerar S. pneumoniae -medierad hjärt små sår hos möss under IPD och tekniker för deras visualisering demonstreras. Möss infekterade med en dos av bakterier som överträffar immunsystemets tröskel för klarering, vilket leder till hög kvalitet bakteriemi, liknande det som sker under mänsklig sepsis, och leder till eventuell bakteriell transloka i hjärtmuskeln. För ännu okänd anledning, S. pneumoniae i hjärtat kan replikera avskräckas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
