Visualizzazione<em> Streptococcus pneumoniae</em> Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco
Summary
Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.
Abstract
Durante batteriemia Streptococcus pneumoniae può traslocare attraverso l'endotelio vascolare nel miocardio e formare batteri-riempite discrete lesioni microscopiche (microlesioni) che sono notevoli per l'assenza di infiltrarsi cellule immunitarie. Grazie alla loro rilascio di prodotti cardiotossici, S. pneumoniae entro microlesioni si pensa di contribuire allo scompenso cardiaco che è spesso osservato durante fulminato malattia pneumococcica invasiva negli adulti. Qui è dimostrato un protocollo per infezione sperimentale del mouse che porta alla formazione di riproducibili microlesion cardiaco entro 30 ore. L'istruzione è fornita sull'identificazione microlesion in ematossilina e eosina sezioni cuore colorato e le distinzioni morfologiche tra inizio e fine microlesioni sono evidenziati. L'istruzione è fornita su un protocollo per la verifica di S. pneumoniae entro microlesioni utilizzando anticorpi contro pneumococco polisaccaride della capsula emicroscopia a immunofluorescenza. Infine, è previsto un protocollo di intervento antibiotico che salva i topi infetti e per l'individuazione e la valutazione di formazione della cicatrice nel cuore dei topi convalescente. Insieme, questi protocolli faciliteranno lo studio dei meccanismi molecolari alla base dell'invasione cardiaco pneumococco, la morte dei cardiomiociti, rimodellamento cardiaco a seguito di esposizione a S. pneumoniae, e la risposta immunitaria al pneumococchi nel cuore.
Introduction
Ricovero di adulti per polmonite acquisita in comunità (CAP) comporta un rischio documentato per eventi avversi cardiaci che contribuisce alla mortalità 1-4. In un recente studio condotto da Corrales-Medina et al. Sono risultati associati con e / o responsabile del 27% dei decessi polmonite associata 3 complicazioni cardiache. Streptococcus pneumoniae (pneumococco), la causa più comune di PAC e sepsi 5, è stata direttamente associata ad eventi avversi cardiaci a ben il 19% dei pazienti adulti ricoverati 6. Eventi cardiaci avversi associati con polmonite includono insufficienza nuovo o peggiorata cardiaco congestizio, aritmie, infarto del miocardio e in ordine decrescente di frequenza 6.
In un recente articolo PLoS Pathogens da Brown et al., S. pneumoniae è risultata capace di traslocazione attraverso l'endotelio vascolare cardiaca, l'ingresso nel myocardium, e la formazione di discrete lesioni microscopiche non purulente (microlesioni) pieni di batteri nei ventricoli durante la malattia pneumococcica invasiva (IPD) 7. Prove di formazione microlesion cardiaca è stata osservata in campioni cardiaci dai primati non umani e gli individui che avevano ceduto alle infezioni da pneumococco. Allo stesso modo, i topi infettati sperimentalmente riproducibile sviluppato microlesioni cardiaci. Nei topi, le dimensioni e il numero microlesion stata positivamente correlata con la durata e la gravità di batteriemia, livelli di troponina cardiaca nel siero, e aberrante elettrofisiologia cardiaca. Traslocazione batterica nel cuore è stato trovato per avvenire attraverso gli stessi meccanismi responsabili traslocazione del pneumococco attraverso la barriera emato-encefalica e lo sviluppo della meningite pneumococcica, vale a dire, la proteina-Colina legame Un'invasione mediata delle cellule endoteliali vascolari in un recettore laminina e piastrine modo dipendente recettore del fattore di -activating 8. Microlesformazione di ioni richiesto anche il pneumococco formano pori tossina pneumolysin che è stato trovato per uccidere cardiomiociti 7.
Microlesioni cardiaci pneumococco sono distinti dal purulenta dei tessuti molli e ascessi cardiaci che sono causate da altri batteri Gram-positivi, tra cui Staphylococcus aureus. Questi sono caratterizzati da un unico foci di batteri circondato da neutrofili e deposizione di fibrina 9,10. Microlesioni formata da S. pneumoniae sono di dimensioni più piccole, distribuiti su tutto il cuore colpito, e la mancanza di infiltrati di cellule immunitarie. Durante le prime fasi dell'infezione, microlesioni causate da S. pneumoniae appaiono come aree di tessuto danneggiato o infiammato ricorda i segni patologici di cardiomiopatia. Alcuni monociti possono essere osservati durante questo tempo, ma la loro presenza è di breve durata e lesioni rapidamente diventa necrotico nell'aspetto e riempito con batteri contemporaneamente continuando a grow dimensioni fino alla morte dell'animale o interventi antimicrobica. È importante sottolineare che, entro 3 giorni di intervento antibiotico, profusa infiltrazione di cellule immunitarie si osserva presso l'ex sede della lesione e questo è accompagnato da una robusta deposizione di collagene. Simile rimodellamento cardiaco è stato riscontrato dopo infarto insieme con conseguenze permanenti sulla funzione cardiaca 11-15. Così, microlesioni sono una potenziale spiegazione per gli eventi avversi cardiaci che si verificano durante IPD e forse la maggiore incidenza di mortalità cardiaca correlata in individui di convalescenza che sono sopravvissuti l'episodio di malattia.
Qui, l'istruzione è disponibile sul modello sperimentale murino di IPD e formazione della lesione cardiaca e la visualizzazione delle microlesioni cardiaci a precoci e tardive fasi dell'infezione. Il protocollo per la rilevazione di deposizione di collagene in animali che sono stati salvati da un intervento antimicrobico è dimostrata. L'obiettivo di questo articolo è quello di facilitate ricerca di altri investigatori su questo importante e nuova patologia pneumococcica.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, un metodo altamente riproducibile per indurre S. pneumoniae mediata microlesioni cardiaci nei topi durante IPD e le tecniche per la loro visualizzazione è dimostrata. I topi sono infettati con una dose di batteri che supera la soglia del sistema immunitario di attestazione, portando a batteriemia alta qualità, simile a quella che si verifica durante la sepsi umana, e conduce ad eventuali traslocazione batterica nel miocardio. Per ragioni ancora sconosciute, S. pneumoniae nel cuore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
