ऊतक अध: पतन / पुनर्जनन और कैंसर के अध्ययन में murine inducible टेलोमिरेज alleles का उपयोग

Summary

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Abstract

Telomere उम्र बढ़ने के दौरान ऊतक अध: पतन का कारण है कि अच्छी तरह से स्थापित ड्राइवरों जीनोम अखंडता और उसके संबंधित डीएनए की क्षति संकेतन और जांच की चौकी प्रतिक्रियाओं का नुकसान कर रहे हैं शिथिलता प्रेरित। घटना की दरों में काफी उम्र के साथ बढ़ रही है साथ कैंसर, छोटी टेलोमेर लंबाई और उच्च टेलोमिरेज गतिविधि की विशेषता है। उम्र बढ़ने और कैंसर में टेलोमेर शिथिलता और टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, प्रोटोकॉल दो murine inducible टेलोमिरेज उत्पन्न करने के लिए कैसे पता चलता है दस्तक में alleles के चार-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-एस्ट्रोजन रिसेप्टर (mTERT-ईआर) और Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT)। प्रोटोकॉल टेलोमेर शिथिलता प्रेरित और vivo में mTERT-ईआर और LSL-mTERT चूहों में टेलोमिरेज गतिविधि को पुन: सक्रिय करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है। प्रतिनिधि डेटा टेलोमिरेज गतिविधि के पुनर्सक्रियन टेलोमेर शिथिलता से प्रेरित ऊतक अपक्षयी phenotypes के उन्नति कर सकते हैं कि पता चलता है। ORD मेंएर tumorigenesis पर टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हम प्रोस्टेट उत्पन्न ट्यूमर मॉडल जी -4 पंजाब-Cre4 PTEN ^{एल / एल} p53 ^{एल / एल} LSL-mTERT ^{एल / एल} और Thymic टी सेल लिंफोमा मॉडल जी -4 एटीएम ^{/ – –} mTERT ^{ईआर / ईआर} । प्रतिनिधि डेटा बहुत tumorigenesis में वृद्धि कर सकते टेलोमेर शिथिलता से प्रेरित जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि में है कि टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन दिखा। प्रोटोकॉल भी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं mTERT-ईआर और LSL-mTERT चूहों से (एनएससी) को अलग करने और इन विट्रो में एनएससी में टेलोमिरेज गतिविधि को पुन: सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं का वर्णन है। प्रतिनिधि डेटा टेलोमिरेज के पुनर्सक्रियन इन विट्रो में आत्म नवीकरण की क्षमता है और न्यूरोजेनेसिस वृद्धि कर सकते हैं कि पता चलता है। अंत में, प्रोटोकॉल दोनों माउस FFPE पर टेलोमेर मछली (सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति) के प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन (formalin तय और Parafफिन एम्बेडेड) मस्तिष्क के ऊतकों और संवर्धित कोशिकाओं का मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों।

Introduction

टेलोमिरेज telomeres को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार एक एंजाइम है। ये उनकी अखंडता की रक्षा कि क्रोमोसोम के सिरों पर दोहराए दृश्यों रहे हैं। टेलोमिरेज holoenzyme के मुख्य घटक एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस उत्प्रेरक सबयूनिट (TERT) और ^1,2 दोहराता telomeric जोड़ने के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है कि एक शाही सेना सबयूनिट (TERC) कर रहे हैं। आम तौर पर विभेदित दैहिक कोशिकाओं में दबा दिया, वहीं टेलोमिरेज मजबूत गतिविधि दर्शाती है और रोगाणु कोशिकाओं, कैंसर की कोशिकाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कोशिकाओं को स्टेम।

mTERC और mTERT पीटा चूहों के स्टेम कोशिकाओं और कैंसर दोनों में टेलोमिरेज के कार्यों का अध्ययन करने के लिए vivo मॉडल प्रणाली में महान प्रदान करते हैं। mTERC और mTERT चूहों (G1) चूहों ³ में telomeres की लंबी रिजर्व की वजह से किसी भी स्पष्ट phenotypes नहीं दिखा था पीटकर। हालांकि, क्रमानुसार देर पीढ़ी (g5 के-G6) को mTERC और mTERT पीटा चूहों intercrossing में हुईअंततः प्रगतिशील telomeres की कटाव और अत्यधिक proliferative ऊतकों ^चार की गंभीर अध: पतन उकसाया। स्वर्गीय पीढ़ी (g5 के-G6) mTERC ^{– / –} चूहों की वजह से वृषण और रोगाणु सेल रिक्तीकरण में apoptosis की उच्च दर के लिए बांझ हैं। इस g5-G6 mTERC ^{– / –} चूहों की वजह से भी ऊतक स्टेम / पूर्वज सेल के डिब्बों ⁴ में apoptosis और दोषपूर्ण आत्म नवीकरण क्षमता की उच्च दर के लिए अस्थि मज्जा, आंत और त्वचा सहित अत्यधिक proliferative ऊतकों में अपक्षयी फेनोटाइप दिखा रहे हैं। देर पीढ़ी की अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं mTERC ^{– / –} चूहों proliferative क्षमता की प्रदर्शनी नुकसान समझौता आत्म नवीकरण की क्षमता, बढ़ाया apoptosis और, अंततः कार्यात्मक थकावट ^{5,6। / – –} चूहों ^7,8 इसी तरह, आंतों तहखाने में उत्तरोत्तर वृद्धि हुई apoptotic निकायों G1-G6 mTERC की एक के बाद एक पीढ़ी में मनाया गया। टीवह बेकार telomeres की हानिकारक प्रभाव गंभीर रूप से देर पीढ़ी (जी -4-g5) में बिगड़ा गया विट्रो में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रसार को और vivo में न्यूरोजेनेसिस दोनों के बाद से उच्च कारोबार ऊतकों तक ही सीमित होना mTERC प्रतीत नहीं होता ^{– / –} चूहों ⁹ । स्टेम कोशिकाओं में टेलोमिरेज की भूमिका आगे कुछ मायनों में ^10,11 उम्र बढ़ने के समय से पहले जैसा दिखता है जो एक दुर्लभ मानव आनुवंशिक विकार dyskeratosis जन्मजात (DKC), में निष्कर्ष द्वारा समर्थित है। DKC dyskerin, एक कोर टेलोमिरेज सबयूनिट, और अन्य dyskerin जुड़े प्रोटीन ¹² सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि TERC, TERT में परिवर्तन, और जीन के कारण होता है। औसत में, DKC रोगियों में telomeres उम्र से मिलान नियंत्रण के कम से कम 99% कर रहे हैं। इस रोग के प्रमुख रुग्णता hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की दोषपूर्ण रखरखाव के कारण होता है जो अप्लास्टिक अनीमिया, की वजह से है। ऐसी मौखिक श्वेतशल्कता, नाखून डिस्ट्रोफी, मानसिक retardati के रूप में रोग के अन्य पहलुओंवृषण शोष और फेफड़े जटिलताओं, पर सभी टेलोमिरेज पीटा चूहों की देर पीढ़ी में ऊतक स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं ^10, उन के साथ घनिष्ठ समझौते में निष्कर्ष के कार्यों बिगड़ा सुझाव देते हैं। DKC रोगियों myelodysplastic सिंड्रोम से ग्रस्त हैं और घातक श्लैष्मिक अर्बुद की एक वृद्धि की व्यापकता है। इस प्रकार, मानव रोगियों में टेलोमिरेज की कमी देर पीढ़ी टेलोमिरेज पीटा चूहों में मनाया जाता है कि स्टेम सेल कार्यों और ट्यूमर गड़बड़ी के दोषों का स्मरण दिलाता है।

लघु telomeres और उच्च टेलोमिरेज गतिविधि कैंसर की पहचान कर रहे हैं। सामान्य या premalignant कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, डीएनए डबल असहाय-विराम (DSBs) ¹³ से उकसाया उन लोगों के समान telomeres और सेलुलर चौकियों की सक्रियता के अंतिम कटाव में कम या अनुपस्थित टेलोमिरेज गतिविधि का परिणाम है। शास्त्रीय DSBs की तरह, टेलोमेर शिथिलता ऐसे वार्धक्य और / या apoptosi के रूप में सेलुलर प्रतिक्रियाओं, p53 के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है और संबद्ध किया गया है^14,15 है। P53 के उत्परिवर्तनीय निष्क्रियता पर, सेल साइकिल चलाना और सेल अस्तित्व ट्रांसलोकेशन और क्षेत्रीय amplifications और विलोपन ^16,17 द्वारा विशेषता एक समर्थक कैंसर mutator तंत्र प्रदान करता है जो टेलोमेर रोग, के साथ कोशिकाओं में बढ़ा रहे हैं। इसी समय, टेलोमेर शिथिलता और (यहां तक कि p53 अशक्त कोशिकाओं में) जुड़े अनियंत्रित गुणसूत्र अस्थिरता जारी रखा इस तरह के कैंसर का पूरा घातक प्रगति विवश करने के लिए दिखाई देते हैं। उदाहरण के लिए, देर पीढ़ी जी -4-g5 के mTERC ^{– / –} Ink4a / एआरएफ ^{– / –} चूहों की वजह से टेलोमेर उदासीनता को Ink4a / एआरएफ अशक्त चूहों के साथ तुलना में काफी कम लिंफोमा घटनाओं से पता चला है। एक अन्य अध्ययन में, जी -4 mTERT में और अधिक उन्नत एडिनोमेटस घावों ^{– / –} एपीसी ^मिनट चूहों बहुत की वजह से महत्वपूर्ण वृद्धि की गिरफ्तारी और apoptosis ^18,19 को एपीसी ^मिनट चूहों के साथ तुलना में दबा दिया गया।टेलोमेर जीनोमिक अस्थिरता शिथिलता प्रेरित अवलोकन है कि ट्यूमर प्रगति टेलोमिरेज की सक्रियता कैंसर सेल व्यवहार्यता और / या निष्क्रिय p53 के आश्रित या स्वतंत्र जांच की चौकी तंत्र के साथ संगत स्तर तक जीनोमिक अस्थिरता शमन के हिस्से में घातक प्रगति सक्षम हो सकता है कि अटकलों का संकेत देता है रोकता।

टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन रोकने के लिए या यहां तक ​​कि स्टेम कोशिकाओं की उम्र बढ़ने रिवर्स, और टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि के खिलाफ tumorigenesis बढ़ावा कर सकते हैं कि क्या कर सकते हैं कि क्या अध्ययन करने के क्रम में, हम दो inducible murine टेलोमिरेज एलील उत्पन्न। पहले एक चार-Hydroxytamoxifen है (4-OHT) -inducible TERT-एस्ट्रोजन रिसेप्टर (mTERT-ईआर) फ्यूजन तोड़े में एलील। 4-OHT के अभाव में, mTERT-ईआर (नामित mTERT ^{ईआर / ईआर)} के लिए समयुग्मक चूहों टेलोमिरेज गतिविधि की कमी कर रहे हैं और पारंपरिक mTERT या एम के रूप में ही सितोगेनिक क और सेलुलर phenotypes को बनाए रखनेTERC पीटकर मॉडल। 4-OHT उपचार करने पर, TERT-ईआर प्रोटीन गतिविधि देशी TERT प्रोटीन ^{20, 21} के लिए तुलनीय स्तर को बहाल किया जा सकता है। दूसरे एलील एक उपन्यास inducible TERT तोड़े में एक intronic LoxP डाट-LoxP कैसेट युक्त एलील (LSL- है mTERT); LSL के छांटना Cre की मध्यस्थता पर, mTERT अंतर्जात अभिव्यक्ति नियंत्रण तंत्र ²² के तहत फिर से व्यक्त किया जाता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी चरणों केन्द्र शासित प्रदेशों के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर द्वारा अनुमोदित किया गया है। MTERT-ईआर एलील की 1. पीढ़ी तोड़े में परिचय ERT2-LBD (Ligand डोमेन बंधन) नदी के ऊपर और (Intron 2 के माध्यम से एक्सॉन 1) mTERT जीनोमिक अनुक्रम के साथ फ्रेम में और एक Lox युक्त वेक्टर लक्ष्य – माउस ES कोशिकाओं में Lox टुकड़ा (चित्रा 1 ए) – PGK – नियो electroporation के साथ। संस्कृति 6-10 दिनों के लिए neomycin में ES कोशिकाओं। Neomycin प्रतिरोधी क्लोन उठाओ और 48 अच्छी तरह से प्लेट में विस्तार। एक वाणिज्यिक किट का उपयोग जीनोमिक डीएनए निकालने और तोड़े में एलील दक्षिणी धब्बा द्वारा पुष्टि करते हैं। एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत C57BL में एक micromanipulation किट के साथ / 6 blastocysts 95% से अधिक सामान्य karyotypes के साथ दो ते लाइनों इंजेक्षन। सरोगेट मां 23 के गर्भाशय में blastocysts प्रत्यारोपण। C57BL 6 / फ़े के लिए उच्च ग्रेड पुरुष chimaeras (70-90%) मेटपुरुषों। दक्षिणी धब्बा द्वारा विषमयुग्मजी mTERT-ERneo जानवरों की जीनोटाइपिंग की पुष्टि करें। NeoR कैसेट को हटाने के लिए विषमयुग्मजी mTERT-ERneo जानवरों और EIIa-Cre जानवरों दोस्त। Homozygosity उत्पन्न करने के लिए कम से कम तीन बार, और आगे अंतर-नस्ल विषमयुग्मजी mTERT-ईआर जानवरों के लिए C57BL 6 / जानवरों के लिए विषमयुग्मजी जानवरों दोस्त। LSL-mTERT एलील की 2. जनरेशन तोड़े में एक LoxP युक्त वेक्टर को लक्षित परिचय – ट्रिपल डाट – नव – LoxP टुकड़ा और electroporation 23 के साथ माउस ES कोशिकाओं में (एक्सॉन एक और Intron 2, चित्रा 1 बी) के बीच mTERT जीनोमिक अनुक्रम। संस्कृति 6-10 दिनों के लिए neomycin में ES कोशिकाओं। Neomycin प्रतिरोधी क्लोन उठाओ और 48 अच्छी तरह से प्लेट में विस्तार। एक वाणिज्यिक किट का उपयोग जीनोमिक डीएनए निकालने और दक्षिणी धब्बा 23 द्वारा तोड़े में एलील की पुष्टि करें। Injeएक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत एक micromanipulation किट के साथ C57BL 6 / blastocysts में 95% से अधिक सामान्य karyotypes साथ सीटी दो ते लाइनों। सरोगेट मां 23 के गर्भाशय में blastocysts प्रत्यारोपण। C57BL 6 / महिलाओं के लिए उच्च ग्रेड पुरुष chimaeras (70-90%) दोस्त। दक्षिणी धब्बा द्वारा विषमयुग्मजी LSL-mTERT जानवरों की जीनोटाइपिंग की पुष्टि करें। कम से कम तीन बार के लिए C57BL 6 / जानवरों के लिए विषमयुग्मजी जानवरों मेट, और आगे अंतर-नस्ल विषमयुग्मजी LSL-mTERT जानवरों homozygosity उत्पन्न करने के लिए। Vivo में mTERT-ईआर और LSL-mTERT चूहे में टेलोमिरेज 3. पुनर्सक्रियकरण MTERT-एर के लिए इंजेक्शन से पहले सभी सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित। 50% (वी / वी) ऑक्सीजन / 50% (वी / वी) dinitrogen मोनोऑक्साइड गैस के मिश्रण में isoflurane के चैम्बर (प्रेरण के लिए 4%, को बनाए रखने के लिए 2%) के साथ चूहों anesthetize। या फिर एक ketamine के xylazine मिश्रण द्वारा चूहों (100 मी anesthetizeग्राम / किलो वजन + 10 मिलीग्राम / किग्रा वजन)। गहरी संज्ञाहरण पर पहुंच गया है, के बाद प्रेरण कक्ष से संवेदनाहृत पशु हटाने, और isoflurane के चैम्बर (2%) से जुड़े ट्यूब के अंदर उनके सिर रखने के लिए। पशु गहरा anaesthetized है सुनिश्चित करने के लिए चूहों के पैर पैड चुटकी। बाहर सुखाने से आंखों को रोकने के क्रम में दोनों आंखों पर मरहम रखो। Povidone आयोडीन समाधान के साथ चूहों के पीछे साफ कर लें। पीठ की त्वचा के नीचे परिशुद्धता trochar (10 जी) के साथ धीमी गति से रिहा 4-OHT गोली इंजेक्षन और दो कंधों के बीच midline के लिए गोली सभी तरह से धक्का। घाव क्लिप एप्लायर साथ चीरा सील और संज्ञाहरण से वसूली के लिए चूहों की निगरानी। 10 दिन बाद क्लिप निकालें। प्रक्रिया शीघ्र ही समाप्त हो गया है, क्योंकि पूरक गर्मी आवश्यक नहीं है। 4-OHT गोली के साथ उपचार की अवधि के अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। LSL-mTERT के लिए <राजभाषा> Tamoxifen (10 मिलीग्राम / एमएल, मक्का का तेल में भंग) (200 उल / 25 ग्राम / दिन) intraperitoneally लगातार दो दिनों इंजेक्ट किया जाता है। तंत्रिका स्टेम सेल और इन विट्रो में टेलोमिरेज के पुनर्सक्रियन 4. अलगाव चूहे कार्बन डाइऑक्साइड के साथ euthanized हैं और दिमाग को हटा रहे हैं। निर्माता के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट के प्रोटोकॉल का पालन करें। नहीं भंवर क्या समाधान 4. के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ समाधान 4 में लेबल शीशी में lyophilized पाउडर Resuspend। यह समाधान तो aliquoted और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। पूर्व गर्मी उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण। समाधान 1 (50 μl) और समाधान 2 (1900 μl): एनजाइम मिक्स 1 बनाओ। समाधान 3 (20 μl) और समाधान 4 (10 μl): एनजाइम मिक्स 2 बनाओ। अप करने के लिए 400 मिलीग्राम ऊतक और भंवर के लिए 1950 μl एंजाइम मिश्रण एक तैयार करें। के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण पूर्व गर्मीउपयोग करने से पहले 15 मिनट। एक दिवसीय माउस दिमाग से बाहर ले लो, और घ्राण बल्ब और सेरिबैलम हटाने के द्वारा forebrains रहते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस में हटाने और दुकान के बाद से ठंड संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में अग्रमस्तिष्क ऊतकों रखें। 1 घंटे के भीतर तंत्रिका ऊतक संसाधित करने के लिए सुनिश्चित करें। पाचन प्रति 400 मिलीग्राम सीमा को पार नहीं कर रहा है सुनिश्चित करने के लिए ऊतक का वजन निर्धारित करते हैं। एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश के ढक्कन पर मस्तिष्क, जगह और एक स्केलपेल का उपयोग मस्तिष्क को कुचलने। HBSS के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग (डब्ल्यू / सीए / एमजी ओ) और वापस एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पिपेट टुकड़े। HBSS के साथ कुल्ला (डब्ल्यू / सीए / एमजी ओ)। अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 × छ पर और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate। पूर्व गर्म एंजाइम मिक्स 1 की 1950 μl (समाधान 1 और 2) प्रति 400 मिलीग्राम ऊतक जोड़ें। Inverting या ट्यूब हर 5 मिनट के झटकों से मिश्रण, 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेते हैं। 20 & # जोड़कर ऊतक का नमूना प्रति 30 μl एंजाइम मिश्रण 2 तैयार करें956; समाधान 4. के 10 μl के लिए समाधान 3 के एल तो नमूना करने के लिए जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे पलटना। भंवर मत करो। यंत्रवत् धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting 10 बार से एक विस्तृत इत्तला दे दी, आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का उपयोग ऊतक अलग कर देना। हवा के बुलबुले के गठन से बचें। ट्यूब हर 3 मिनट inverting, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कदम 4.11 दोहराएँ और ऊतकों 200 मिलीग्राम से भी बड़ा रहे हैं अगर 4.12 कदम। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर रखा एक 70 माइक्रोन सेल झरनी, सेल निलंबन लागू करें। सेल झरनी के माध्यम से पीबीएस के 10 एमएल लागू करें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेल झरनी और अपकेंद्रित्र सेल निलंबन त्यागें। महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला। आगे अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक मात्रा करने के लिए स्टेम सेल के माध्यम से कोशिकाओं Resuspend। , LSL-mTERT एनएससी में टेलोमिरेज को सक्रिय दो दिनों के लिए 100 माइक्रोन 4-OHT के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए। 100 माइक्रोन 4 के साथ मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं को रखने के लिए, mTERT-ईआर एनएससी में टेलोमिरेज सक्रिय करने के लिए-OHT। 5. telomere मछली संवर्धित कोशिकाओं से मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों तैयार करें। FFPE (formalin तय और आयल एम्बेडेड) ऊतक वर्गों, xylene में deparaffinize और 5 मिनट प्रत्येक (100%, 90%, 70%, 50% इथेनॉल) और 5 मिनट के लिए पीबीएस के लिए इथेनॉल श्रृंखला में rehydrate के लिए। मेथनॉल में पोस्ट-तय: एसिटिक एसिड (3: 1) 1-2 घंटे के लिए। 5 मिनट के प्रत्येक (70%, 90%, 100% इथेनॉल) और शुष्क हवा के लिए ठंड इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलीकरण। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में धो लें। 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4% formaldehyde के में गुणसूत्रों denature। ठंड इथेनॉल श्रृंखला में 5 मिनट के प्रत्येक (70%, 90%, 100% इथेनॉल) और शुष्क हवा निर्जलीकरण। प्रत्येक स्लाइड के लिए PNA संकरण मिश्रण की 12-25 μl लागू करें। (संकरण मिश्रण: 70% Formamide, 0.06x एसएससी, 0.2% बीएसए, 0.5 एनजी / μl tRNA, 0.5 एनजी / μl टेलोमेर या गुणसूत्रबिंदु जांच) रबर सीमेंट के साथ कवर पर्ची सील। 4 मीटर के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट-denature गुणसूत्र preps और ऊतक वर्गोंमें। कमरे के तापमान पर संकरण या उमस भरे कक्ष में 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस। वाशिंग बफर 2 एक्स 15 मिनट के साथ कमरे के तापमान पर धो लें। (धो बफर: 70% Formamide, 0.06x एसएससी, पीएच 7.2)। PBST के साथ कमरे के तापमान पर 3 एक्स 5 मिनट धो लें। सूक्ष्म परीक्षा के लिए DAPI या दूर-लाल प्रतिदीप्ति साथ काउंटर दाग स्लाइड।

Representative Results

रणनीतियों murine mTERT-ईआर उत्पन्न करने के लिए और LSL-mTERT तोड़े में alleles के चित्रा 1 ए और 1 बी में वर्णित किया गया। विशेष रूप से, एक LoxP – ट्रिपल डाट – नव – LoxP टुकड़ा LSL-mTERT एलील उत्पन्न करने के लिए एक्सॉन एक और mTERT ठिकाना की एक्सॉन 2 के बीच डाला गया था। MTERT-ईआर एलील उत्पन्न करने के लिए, mTERT जीन के साथ फ्रेम में ERT2-LBD डोमेन हम दिखाया एक्सॉन 1. के एन टर्मिनस में डाला गया था कि टेलोमिरेज क्षणिक 4 के लिए चार-OHT छर्रों के साथ उन्हें इलाज से टेलोमेर शिथिलता चूहों में पुन: सक्रिय हो गया था जब सप्ताह, अपक्षयी phenotype के कई ऐसे मस्तिष्क (2A चित्रा) के रूप में अंगों और वृषण (चित्रा 2B) में ameliorated जा सकता है। देर पीढ़ी जी -4 LSL-mTERT और जी -4 mTERT से इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं पर टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हम पृथक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी)एर चूहों। हम टेलोमिरेज टेलोमेर बेकार एनएससी में पुनः सक्रिय था, एनएससी की आत्म नवीकरण क्षमता बहुत भी काफी (3B चित्रा) बढ़ाया गया था (चित्रा 3 ए) में वृद्धि हुई है, और इन विट्रो न्यूरोजेनेसिस में किया गया था कि पता चला है। टेलोमेर शिथिलता के संदर्भ में tumorigenesis पर टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हम उत्पन्न पीबी-Cre4 PTEN एल / एल p53 एल / एल LSL-mTERT एल / एल (प्रोस्टेट ट्यूमर मॉडल) और एटीएम – / – mTERT ईआर / ईआर (Thymic टी सेल लिंफोमा मॉडल) देर पीढ़ी साथियों। टेलोमिरेज 8 सप्ताह (4B चित्रा) के लिए इंजेक्शन (चित्रा -4 ए) या ​​4-OHT छर्रों के साथ इन चूहों में tamoxifen के उपचार के द्वारा फिर सक्रिय किया गया था, tumorigenesis बहुत दोनों प्रोस्टेट ट्यूमर मॉडल (चित्रा -4 ए) और Thymic टी सेल लिंफोमा मॉडल में बढ़ाया गया था ( <stronG> 4B चित्रा)। अन्त में, हम FFPE माउस मस्तिष्क के ऊतकों पर टेलोमेर मछली प्रदर्शन के प्रोटोकॉल (चित्रा 5) और मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों (चित्रा 5, इनसेट) की सूचना दी। चित्रा 1: (ए) mTERT-ईआर तोड़े में रणनीति। वेक्टर को लक्षित टीवी,; गुम्मट, जंगली प्रकार एलील; केआई, तोड़े में एलील; ला, बाएं हाथ; आरए, दाहिने हाथ; ई 1, एक्सॉन 1; E2, एक्सॉन 2; नव, PGK neomycin प्रतिरोधी जीन प्रमोटर संचालित; ईआर, संशोधित एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ERT2) ligand के डोमेन बाध्यकारी; डीटी, dyphteria विष जीन। (बी) LSL-mTERT तोड़े में रणनीति। वेक्टर को लक्षित टीवी,; गुम्मट, जंगली प्रकार एलील; केआई, तोड़े में एलील; ला, बाएं हाथ; आरए, दाहिने हाथ; ई 1, एक्सॉन 1; E2, एक्सॉन 2; नव, PGK neomycin प्रतिरोधी जीन प्रमोटर संचालित; डाट, तीन दोहराए ट्रांसक्रिप्शनल रोक दृश्यों; डीटी, dyphteria विष जीन। <pके लिए वर्ग = "jove_content": रख-together.within पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 2: प्रतिनिधि डेटा टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन दिखाने के लिए अंगों के अपक्षयी phenotypes के ameliorates दिमाग के प्रतिनिधि छवियों (बाएं)। और वृषण (दाएं) प्लेसबो या चार हफ्तों के लिए चार-OHT के साथ इलाज G0 और जी -4 mTERT-ईआर चूहों की। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन से संकेत मिलता है। फिर से प्रिंट 20 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3:। प्रतिनिधि डेटा टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन दिखाने के लिए आत्म नवीकरण और इन विट्रो में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोजेनेसिस को बढ़ाता है (ए) तंत्रिका स्टेम सेल के प्रतिनिधि छवियोंजी -4 LSL-mTERT से अलग है (ऊपरी पैनल) और जी -4 mTERT-ईआर (कम पैनल) वाहन या 4 OHT के साथ इलाज स्टेम सेल के माध्यम में बढ़ रहा है। (बी) के भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत जी -4 mTERT-ईआर से अलग तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो न्यूरोजेनेसिस (Tuj1 +) के प्रतिनिधि छवियों (1% FBS के साथ) वाहन या 4 OHT के साथ इलाज किया। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। चित्रा 4:। टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन दिखाने के लिए प्रतिनिधि डेटा जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि के खिलाफ tumorigenesis को बढ़ाता है (ए) / एल p53 एल / एल LSL-mTERT G0 पीबी-Cre4 PTEN एल से विच्छेदित प्रोस्टेट ट्यूमर के प्रतिनिधि छवियाँ +/-, जी -4 PB- Cre4 PTEN एल / एल p53 एल / एल LSL-mTERT- / -, और जी -4 पंजाब-Cre4 PTEN एल / एल p53 एल / एल LSL-mTERT एल / एल tamoxifen के साथ इलाज किया। 22 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट। (बी) G0 एटीएम से विच्छेदित Thymic टी सेल लिंफोमा के प्रतिनिधि छवियों – / – mTERT / + ईआर, जी -4 एटीएम / – – mTERT ईआर / ईआर वाहन के साथ व्यवहार किया है, और जी -4 के एटीएम / – – mTERT ईआर / ईआर 4- साथ इलाज 8 सप्ताह के लिए OHT। स्केल सलाखों 1 सेमी से संकेत मिलता है। चित्रा 5: FFPE माउस मस्तिष्क के ऊतकों और मेटाफ़ेज़ (इनसेट) पर telomeric और centromeric मछली के प्रतिनिधि छवियाँ। लाल, हरे टेलोमेर धुंधला इंगित करता है, डीएनए को इंगित करता है, और सियान सीई इंगित करता हैntromere धुंधला। स्केल सलाखों 1 मिमी से संकेत मिलता है।

Discussion

यहाँ, हम दो inducible murine टेलोमिरेज एलील और कैसे vivo में इन विट्रो में टेलोमिरेज पुन: सक्रिय करने की पीढ़ी की रिपोर्ट। mTERT-ईआर गतिविधि के फिर सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण कदम टेमोक्सीफेन की एक सतत एकाग्रता रखने के लिए है, इसलिए हम अमेरिका के इनोवेटिव रिसर्च द्वारा निर्मित 4-OHT समय रिलीज छर्रों का उपयोग करने के लिए चुनते हैं। छर्रों अप करने के लिए 60 दिनों के लिए एक एनजी / एमएल के एक स्थिर राज्य रक्त स्तर पर 4OHT रिहा रहते हैं। पिछले एक अध्ययन में, हम इस रणनीति के साथ टेलोमिरेज गतिविधि के फिर सक्रिय ऐसे स्टेम सेल थकावट, जी -4 mTERT ^{ईआर / ईआर} में टेलोमेर शिथिलता द्वारा प्रेरित किया गया है कि कई अंगों में ऊतक चोट प्रतिक्रियाएं और अंग विफलता की हानि के रूप में अपक्षयी phenotypes के उन्नति करने में सक्षम था कि पता चला चूहों ^20।

बुढ़ापे में टेलोमिरेज के समारोह का अध्ययन करने के अलावा, इन दो inducible टेलोमिरेज एलील भी कैंसर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों में ले लियाइन एलील का लाभ जीनोम को आकार देने और टी सेल Thymic लिंफोमा ²¹ और प्रोस्टेट कैंसर के ²² के जीव विज्ञान को प्रभावित करने में टेलोमेर उदासीनता और टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन की भूमिका का पता लगाने के लिए। इन दोनों के अध्ययन से पता चला है कि देर पीढ़ी जी -4 एटीएम में टेलोमेर शिथिलता ^{– / –} mTERT ^{ईआर / ईआर} और जी -4 पंजाब-Cre4 PTEN ^{एल / एल} p53 ^{एल / एल} LSL-mTERT ^{एल / एल} चूहों के लिए जल्दी mutagenic घटनाओं के अधिग्रहण के ईंधन भरने के लिए एक तंत्र प्रदान करता है ट्यूमर दीक्षा, अभी तक पूरी तरह से घातक ट्यूमर को बढ़ने से रोकता है। टेलोमिरेज टेलोमेर शिथिलता प्रेरित जीनोमिक अस्थिरता, डीएनए की क्षति चौकियों और अनियंत्रित गुणसूत्र अस्थिरता के संदर्भ में पुन: सक्रिय हो गया था जब इस तरह के प्रोस्टेट कैंसर के ²¹ की हड्डी मेटास्टेसिस और thymi के मस्तिष्क घुसपैठ के रूप में नए जैविक गुणों के साथ घातक ट्यूमर का पूरा प्रगति की अनुमति दी है, जो दबा दिया गयासी लिंफोमा ^21। इसी प्रकार घटनाएं भी पेट के कैंसर और अग्नाशय के कैंसर (डीआरएस। Haoqiang यिंग, एडम Boutin और रोनाल्ड DePinho के साथ व्यक्तिगत संचार) सहित अन्य प्रकार के कैंसर में मनाया गया।

TERT-ईआर प्रोटीन आसानी से जानवरों टेमोक्सीफेन या वाहन के साथ व्यवहार कर रहे हैं, इस पर निर्भर राज्यों पर बीच और बंद toggled जा सकता है, क्योंकि mTERT-ईआर एलील द्वारा उत्पन्न ट्यूमर मॉडल विरोधी टेलोमिरेज चिकित्सा परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। पिछले अध्ययन में, ट्यूमर जी -4 एटीएम में उत्पन्न ^{– / –} mTERT ^{ईआर / ईआर} जानवरों 4-OHT से जारी किए गए; टेलोमिरेज कमी पर, ट्यूमर की वजह से आखिरकार टेलोमेर शिथिलता प्रेरित चौकियों ²¹ की बहाली के लिए सिकुड़ गया। हालांकि, जवाब में प्रतिरोध का अधिग्रहण ट्यूमर के कुछ Telomeres (एएलटी) तंत्र का एक वैकल्पिक लंबी सक्रिय द्वारा विलुप्त होने टेलोमिरेज करने के लिए। इन Alt + प्रतिरोधी ट्यूमर के आगे लक्षण वर्णन है कि टी पता चलाअरे माइटोकॉन्ड्रियल संश्लेषण और oxidative रक्षा PGC-1β के एक मास्टर नियामक सहित माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान और oxidative रक्षा में शामिल जीनों की न्यायपालिका प्रतिलेखन है। टेलोमिरेज + ट्यूमर कोशिकाओं को ²¹ अपेक्षाकृत बरकरार रहेगा रखने जबकि PGC-1β या SOD2 (ऑक्सीडेटिव रक्षा का एक और नियामक) की पछाड़ना काफी Alt + ट्यूमर कोशिकाओं को समाप्त।

इन दो तोड़े में alleles की एक सीमा है कि वे टेलोमिरेज जीन के जन्म का ठिकाना में हैं, क्योंकि वे केवल अंतर्जात स्तर पर टेलोमिरेज के पुनर्सक्रियन बर्दाश्त कर सकते हैं। सबसे अधिक मानव में कैंसर, टेलोमिरेज वास्तव में एक बहुत उच्च स्तर पर overexpressed है। टेलोमिरेज के स्तर को बढ़ाने के क्रम में, हम विचार कर सकते हैं एक संशोधन ऐसे Rosa26 ठिकाना में PGK (phosphoglycerate काइनेज) के प्रमोटर के रूप में एक मजबूत प्रमोटर के साथ mTERT-ईआर निर्माण डालने के लिए है।

अंत में, इन दो उपन्यास inducible murine टेलोमिरेज alleles के अभूतपूर्व गेनेट प्रदान करते हैंआईसी उपकरण विशेष रूप से पूर्व अधिग्रहीत टेलोमेर शिथिलता प्रेरित जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि के तहत, उम्र बढ़ने और ऊतक homeostasis के साथ ही ट्यूमर प्रगति में टेलोमिरेज के कार्यों का अध्ययन करने के लिए। mTERT-ईआर एलील भी अन्य ट्यूमर होने का खतरा माउस मॉडल में पार करके विरोधी टेलोमिरेज चिकित्सा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Materials

Leica AM6000 Micromanipulation Kit	Leica	Per quote
Leica DMI6000 B inverted microscope	Leica	Per quote
Neomycin	Life technologies	21810031
isoflurane vaporizer	Veterinary Anesthesia Systems	911103
isoflurane	Henry Schein	1005796
ketamine-xylazine mixture	Sigma-Aldrich	K113-10ML
4-OHT powder	Sigma-Aldrich	H7904-5MG
Tamoxfien	Sigma-Aldrich	T5648-1G
4-OHT pellet	Innovative Research of America	Custermized
Precision Trochar (10 Gauge)	Innovative Research of America	MP-182
wound clip applier	Fischer Scientific	01-804
clip	Fischer Scientific	01-804-5
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-092-628
HBSS	Life technologies	14025092
PBS	Life technologies	10010023
xylene	Fischer Scientific	X3P-1GAL
methanol	Fischer Scientific	A-433S4
acetic acid	Fischer Scientific	A38-500
ethanol	Fischer Scientific	22-032-104
formamide	Fischer Scientific	F84-1
PNA telomere probe	Panagene	F1001-5
PNA centromere probe	Panagene	F3003-5
20X SSC	Fischer Scientific	BP1325-4
BSA	Sigma-Aldrich	A2153-10G
tRNA	Sigma-Aldrich	R5636-1ML
Tween 20	Fischer Scientific	BP337-100
rubber cement	Walmart	Elmer's
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542