Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.
Telomer dysfunktion-induceret tab af genom integritet og dens tilhørende DNA-skader signalering og Checkpoint reaktioner er veletablerede drivere, der forårsager væv degeneration under ældning. Kræft, med incidensrater stærkt stigende med alderen, er præget af korte telomer længder og høj telomerase-aktivitet. For at undersøge roller telomer dysfunktion og telomerase reaktivering i aldring og kræft, protokollen viser, hvordan man kan generere to murine inducerbar telomerase knock-in alleler 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducerbare TERT-østrogen-receptor (mTERT-ER) og Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Protokollen beskriver procedurerne for at inducere telomer dysfunktion og genaktivere telomeraseaktivitet i mTERT-ER og LSL-mTERT mus in vivo. De repræsentative data viser, at reaktivering af telomerase-aktivitet kan lindre væv degenerative fænotyper induceret af telomer dysfunktion. I ordER for at fastslå virkningen af telomerase reaktivering på tumorigenese, vi genereret prostata tumor model G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L og thymus T-celle lymfom model G4 Atm – / – mTERT ER / ER . De repræsentative data viser, at telomerase reaktivering i baggrund af genomisk ustabilitet induceret af telomer dysfunktion kan i høj grad øge tumorigenese. Protokollen beskriver også de procedurer, der anvendes til at isolere neurale stamceller (NSC) fra mTERT-ER og LSL-mTERT mus og genaktivere telomeraseaktivitet i NSC in vitro. De repræsentative data viser, at reaktivering af telomerase kan øge selvfornyelse kapacitet og neurogenese in vitro. Endelig protokollen beskriver procedurerne for udførelse af telomer FISH (fluorescens in situ hybridisering) på både mus FFPE (Formalin Faste og parafFIN indbygget) hjernevæv og metafasekromosomer af dyrkede celler.
Telomerase er et enzym ansvarligt for opretholdelse af telomerer. Disse er repetitive sekvenser ved enderne af kromosomer, der beskytter deres integritet. De centrale komponenter af telomerase holoenzymet er en revers transkriptase-katalytiske underenhed (TERT) og en RNA-underenhed (tert), der tjener som template for tilsætning af telomere gentager 1,2. Mens generelt undertrykt i differentierede somatiske celler telomerase udviser robust aktivitet og spiller vigtige roller i kimceller, cancerceller og stamceller.
mTERC og mTERT knockout-mus giver stor in vivo modelsystemer til at studere funktioner telomerase i både stamceller og kræft. Den mTERC og mTERT knockout-mus (G1) viste ingen åbenlyse fænotyper grund af den lange reserve af telomerer i mus 3. Men serielt Krydsning mTERC og mTERT knockout-mus til sent generation (G5-G6) resulterede igradvis erosion af telomerer og til sidst provokeret svær degeneration af stærkt proliferative væv 4. Sen generation (G5-G6) mTERC – / – mus er infertile på grund af de høje apoptose i testikler og kim cellereduktion. G5-G6 mTERC – / – mus også udviser degenerative fænotyper i højt proliferative væv, herunder knoglemarv, tarm og hud på grund af høje apoptose og defekte selvfornyelse kapacitet i væv stamceller / progenitorcelle rum 4. Hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven af sene generation mTERC – / – mus udviser tab af proliferativ potentiale, kompromitteret selvfornyelse kapacitet, forbedret apoptose og i sidste ende funktionel udmattelse 5,6. Tilsvarende blev gradvist øget apoptotiske organer i tarm krypter observeret i hver efterfølgende generation af G1-G6 mTERC – / – mus 7,8. THan skadelig virkning af dysfunktionelle telomerer synes ikke at være begrænset til høje omsætning væv da både spredning af voksne neurale stamceller in vitro og neurogenese in vivo blev alvorligt forringet i slutningen generation (G4-G5) mTERC – / – mus 9 . Rolle telomerase i stamceller understøttes yderligere af resultaterne i en sjælden menneskelig genetisk sygdom dyskeratosis congenita (DKC), som på nogle måder ligner tidlig ældning 10,11. DKC er forårsaget af mutationer i tert, TERT, og gener, der koder dyskerin, en kerne telomerase-underenhed og andre dyskerin associerede proteiner 12. I gennemsnit telomerer i DKC patienter er kortere end 99% af aldersmatchede kontroller. Den største sygdommens morbiditet skyldes aplastisk anæmi, som er forårsaget af en defekt ved opretholdelse af hæmatopoietiske stamceller. Andre aspekter af sygdommen, såsom oral leukoplakia, negle dystrofi, psykiske retardatipå, testiklerne atrofi og pulmonale komplikationer alle foreslår forringet funktioner af væv stamceller og stamceller 10, fund i tæt overensstemmelse med dem i slutningen generation af telomerase knockout-mus. DKC patienter er tilbøjelige til myelodysplastisk syndrom og har en øget forekomst af maligne slimhinder neoplasmer. Således mangel af telomerase i humane patienter rekapitulerer manglerne i stamceller funktioner og tumor disposition, som observeres i slutningen generation telomerase knockout-mus.
Korte telomerer og høj telomeraseaktivitet er kendetegnende for kræft. Som normale eller præmaligne celler deler de lave eller fraværende telomerase aktivitet resulterer i eventuel erosion af telomerer og aktivering af cellulære checkpoints ligner dem fremkaldt af DNA dobbeltstrengede-pauser (DSBs) 13. Ligesom klassiske DSBs har telomer dysfunktion blevet vist at inducere p53 og tilhørende cellulære responser, såsom ældning og / eller apoptosis 14,15. Ved mutations inaktivering af p53, er celle cykling og celleoverlevelse forbedret i celler med telomer dysfunktion, som giver en pro-kræftfremkaldende mutator mekanisme præget af translokationer og regionale forstærkninger og sletninger 16,17. Samtidig fortsatte telomer dysfunktion og tilhørende omsiggribende kromosomale ustabilitet (selv i p53 nulceller) synes at begrænse fuld malign progression af sådanne cancerformer. For eksempel sen generation G4-G5 mTERC – / – INK4a / ARF – / – mus viste signifikant reduceret lymfom incidens sammenlignet med INK4a / ARF null mus på grund af telomer nedslidning. I en anden undersøgelse mere avancerede adenomatøs læsioner i G4 mTERT – / – APC min mus blev stærkt undertrykt i sammenligning med APC min mus på grund af en betydelig vækst og apoptose 18,19. Deniagttagelse, at telomer dysfunktion induceret genomisk ustabilitet hæmmer tumorudvikling prompter spekulationer om, at aktivering af telomerase kan muliggøre malign progression delvist ved undertrykke genomisk ustabilitet til et niveau foreneligt med levedygtighed cancercelle og / eller neutraliserende p53-afhængige eller -uafhængige checkpoint mekanismer.
For at undersøge, om telomerase reaktivering kan stoppe eller endog vende aldring af stamceller, og hvorvidt telomerase reaktivering kan fremme tumorigenesis på baggrund af genomisk ustabilitet, vi genererede to inducerbare murine telomerase alleler. Den første er 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducerbare TERT-østrogen-receptor (mTERT-ER) fusion knock-in allel. I mangel af 4-OHT, mus homozygote for mTERT-ER (betegnet mTERT ER / ER) er telomeraseaktivitet mangelfuld og opretholde samme cytogenetiske og cellulære fænotyper som konventionel mTERT eller mTert knockout model. Ved 4-OHT behandling, kan TERT-ER proteinaktivitet gendannes til et niveau svarende til det native TERT protein 20, 21. Den anden allel er en roman inducerbart TERT knock-in allel indeholdende en intronisk LoxP-Prop-LoxP kassette (LSL- mTERT); upon Cre-medieret udskæring af LSL, mTERT er re-udtrykkes under endogene udtryk kontrolmekanismer 22.
Her rapporterer vi genereringen af to inducerbare murine telomerase alleler, og hvordan at genaktivere telomerase in vivo og in vitro. Den kritiske trin for reaktivering mTERT-ER-aktivitet er at holde en konstant koncentration af tamoxifen, så vi vælger at bruge 4-OHT tid-frigivelse pellets fremstillet af Innovative Research of America. Pelleterne holde frigive 4OHT ved en steady state blodniveau af 1 ng / ml i op til 60 dage. I en tidligere undersøgelse, viste vi, at reaktivering telomeraseaktivitet med denne strategi var i stand til forbedring af degenerative fænotyper såsom stamceller udmattelse, svækkelse af væv skade reaktioner og organsvigt i flere organer, som blev fremkaldt af telomer dysfunktion i G4 mTERT ER / ER mus 20.
Andre end at studere funktionen af telomerase i aldring, kan disse to inducerbare telomerase alleler også anvendes til at studere cancer. Tidligere undersøgelser togfordel af disse alleler at udforske den rolle, telomer nedslidning og telomerase reaktivering i udformningen genomer og påvirker biologi T-celle thymus lymfom 21 og prostatakræft 22. Disse to undersøgelser viste, at telomer dysfunktion i slutningen generation G4 Atm – / – mTERT ER / ER og G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L-mus giver en mekanisme næring erhvervelsen af tidlige mutagene begivenheder for tumor initiering, men forhindre progression af fuldt maligne tumorer. Når telomerase reaktiveret i forbindelse med telomer dysfunktion induceret genomisk ustabilitet, DNA damage checkpoints og omsiggribende kromosomale ustabilitet blev undertrykt, hvilket tillod fuldstændig progression af maligne tumorer med nye biologiske egenskaber, såsom knoglemetastaser af prostatacancer 21 og hjerne infiltration af Thymic lymfom 21. Lignende fænomener blev også observeret i andre kræfttyper, herunder tyktarmskræft og kræft i bugspytkirtlen (personlig kommunikation med Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin og Ronald DePinho).
Fordi TERT-ER-protein let kan skiftes mellem tændt og slukket tilstande afhængig af, om dyrene behandlet med tamoxifen eller et køretøj, kan tumormodeller genereret af mTERT-ER allel udnyttes til at teste anti-telomerase terapi. I tidligere undersøgelse, tumorer genereres i G4 Atm – / – mTERT ER / ER dyr blev frigivet fra 4-OHT; på telomerase udtynding, tumorer til sidst faldt på grund af genindsættelse af telomer dysfunktion-induceret checkpoints 21. Men nogle af tumorerne erhvervede resistens i respons på telomerase-udslettelse ved at aktivere et alternativt forlængelse af Telomerer (ALT) mekanisme. Yderligere karakterisering af disse ALT + tumorer viste, at they har afvigende transskription af gener involveret i mitokondrie biologi og oxidativ forsvar, herunder en master regulator af mitokondrie syntese og oxidativ forsvar PGC-1β. Knockdown af PGC-1β eller SOD2 (en anden regulator af oxidativ forsvar) signifikant fjerner ALT + tumorceller, mens holde telomerase + tumorceller forbliver relativt intakt 21.
En begrænsning af disse to knock-in alleler er, at de kun kan tillade reaktivering af telomerase på endogent niveau, fordi de er i det native locus af telomerase-genet. I de fleste humane kræftformer, er telomerase faktisk overudtrykt på et langt højere niveau. For at øge niveauet af telomerase, en modifikation kan vi overveje, er at indsætte mTERT-ER-konstruktion med en stærkere promotor, såsom PGK (phosphoglyceratkinase) -promotor i Rosa26 locus.
Afslutningsvis disse to hidtil ukendte inducerbare murine telomerase alleler giver hidtil uset Genetic værktøjer til at studere funktioner telomerase i aldring og vævshomeostase samt tumorprogression, især under baggrund af præ-erhvervet telomer dysfunktion induceret genomisk ustabilitet. Den mTERT-ER allel kan også anvendes til at studere anti-telomerase behandling ved passage i andre tumor-tilbøjelige musemodeller.
The authors have nothing to disclose.
J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).
Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
HBSS | Life technologies | 14025092 | |
PBS | Life technologies | 10010023 | |
xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
rubber cement | Walmart | Elmer's | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |