Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.
Telomere उम्र बढ़ने के दौरान ऊतक अध: पतन का कारण है कि अच्छी तरह से स्थापित ड्राइवरों जीनोम अखंडता और उसके संबंधित डीएनए की क्षति संकेतन और जांच की चौकी प्रतिक्रियाओं का नुकसान कर रहे हैं शिथिलता प्रेरित। घटना की दरों में काफी उम्र के साथ बढ़ रही है साथ कैंसर, छोटी टेलोमेर लंबाई और उच्च टेलोमिरेज गतिविधि की विशेषता है। उम्र बढ़ने और कैंसर में टेलोमेर शिथिलता और टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, प्रोटोकॉल दो murine inducible टेलोमिरेज उत्पन्न करने के लिए कैसे पता चलता है दस्तक में alleles के चार-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-एस्ट्रोजन रिसेप्टर (mTERT-ईआर) और Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT)। प्रोटोकॉल टेलोमेर शिथिलता प्रेरित और vivo में mTERT-ईआर और LSL-mTERT चूहों में टेलोमिरेज गतिविधि को पुन: सक्रिय करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है। प्रतिनिधि डेटा टेलोमिरेज गतिविधि के पुनर्सक्रियन टेलोमेर शिथिलता से प्रेरित ऊतक अपक्षयी phenotypes के उन्नति कर सकते हैं कि पता चलता है। ORD मेंएर tumorigenesis पर टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हम प्रोस्टेट उत्पन्न ट्यूमर मॉडल जी -4 पंजाब-Cre4 PTEN एल / एल p53 एल / एल LSL-mTERT एल / एल और Thymic टी सेल लिंफोमा मॉडल जी -4 एटीएम / – – mTERT ईआर / ईआर । प्रतिनिधि डेटा बहुत tumorigenesis में वृद्धि कर सकते टेलोमेर शिथिलता से प्रेरित जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि में है कि टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन दिखा। प्रोटोकॉल भी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं mTERT-ईआर और LSL-mTERT चूहों से (एनएससी) को अलग करने और इन विट्रो में एनएससी में टेलोमिरेज गतिविधि को पुन: सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं का वर्णन है। प्रतिनिधि डेटा टेलोमिरेज के पुनर्सक्रियन इन विट्रो में आत्म नवीकरण की क्षमता है और न्यूरोजेनेसिस वृद्धि कर सकते हैं कि पता चलता है। अंत में, प्रोटोकॉल दोनों माउस FFPE पर टेलोमेर मछली (सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति) के प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन (formalin तय और Parafफिन एम्बेडेड) मस्तिष्क के ऊतकों और संवर्धित कोशिकाओं का मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों।
टेलोमिरेज telomeres को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार एक एंजाइम है। ये उनकी अखंडता की रक्षा कि क्रोमोसोम के सिरों पर दोहराए दृश्यों रहे हैं। टेलोमिरेज holoenzyme के मुख्य घटक एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस उत्प्रेरक सबयूनिट (TERT) और 1,2 दोहराता telomeric जोड़ने के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है कि एक शाही सेना सबयूनिट (TERC) कर रहे हैं। आम तौर पर विभेदित दैहिक कोशिकाओं में दबा दिया, वहीं टेलोमिरेज मजबूत गतिविधि दर्शाती है और रोगाणु कोशिकाओं, कैंसर की कोशिकाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कोशिकाओं को स्टेम।
mTERC और mTERT पीटा चूहों के स्टेम कोशिकाओं और कैंसर दोनों में टेलोमिरेज के कार्यों का अध्ययन करने के लिए vivo मॉडल प्रणाली में महान प्रदान करते हैं। mTERC और mTERT चूहों (G1) चूहों 3 में telomeres की लंबी रिजर्व की वजह से किसी भी स्पष्ट phenotypes नहीं दिखा था पीटकर। हालांकि, क्रमानुसार देर पीढ़ी (g5 के-G6) को mTERC और mTERT पीटा चूहों intercrossing में हुईअंततः प्रगतिशील telomeres की कटाव और अत्यधिक proliferative ऊतकों चार की गंभीर अध: पतन उकसाया। स्वर्गीय पीढ़ी (g5 के-G6) mTERC – / – चूहों की वजह से वृषण और रोगाणु सेल रिक्तीकरण में apoptosis की उच्च दर के लिए बांझ हैं। इस g5-G6 mTERC – / – चूहों की वजह से भी ऊतक स्टेम / पूर्वज सेल के डिब्बों 4 में apoptosis और दोषपूर्ण आत्म नवीकरण क्षमता की उच्च दर के लिए अस्थि मज्जा, आंत और त्वचा सहित अत्यधिक proliferative ऊतकों में अपक्षयी फेनोटाइप दिखा रहे हैं। देर पीढ़ी की अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं mTERC – / – चूहों proliferative क्षमता की प्रदर्शनी नुकसान समझौता आत्म नवीकरण की क्षमता, बढ़ाया apoptosis और, अंततः कार्यात्मक थकावट 5,6। / – – चूहों 7,8 इसी तरह, आंतों तहखाने में उत्तरोत्तर वृद्धि हुई apoptotic निकायों G1-G6 mTERC की एक के बाद एक पीढ़ी में मनाया गया। टीवह बेकार telomeres की हानिकारक प्रभाव गंभीर रूप से देर पीढ़ी (जी -4-g5) में बिगड़ा गया विट्रो में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रसार को और vivo में न्यूरोजेनेसिस दोनों के बाद से उच्च कारोबार ऊतकों तक ही सीमित होना mTERC प्रतीत नहीं होता – / – चूहों 9 । स्टेम कोशिकाओं में टेलोमिरेज की भूमिका आगे कुछ मायनों में 10,11 उम्र बढ़ने के समय से पहले जैसा दिखता है जो एक दुर्लभ मानव आनुवंशिक विकार dyskeratosis जन्मजात (DKC), में निष्कर्ष द्वारा समर्थित है। DKC dyskerin, एक कोर टेलोमिरेज सबयूनिट, और अन्य dyskerin जुड़े प्रोटीन 12 सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि TERC, TERT में परिवर्तन, और जीन के कारण होता है। औसत में, DKC रोगियों में telomeres उम्र से मिलान नियंत्रण के कम से कम 99% कर रहे हैं। इस रोग के प्रमुख रुग्णता hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की दोषपूर्ण रखरखाव के कारण होता है जो अप्लास्टिक अनीमिया, की वजह से है। ऐसी मौखिक श्वेतशल्कता, नाखून डिस्ट्रोफी, मानसिक retardati के रूप में रोग के अन्य पहलुओंवृषण शोष और फेफड़े जटिलताओं, पर सभी टेलोमिरेज पीटा चूहों की देर पीढ़ी में ऊतक स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं 10, उन के साथ घनिष्ठ समझौते में निष्कर्ष के कार्यों बिगड़ा सुझाव देते हैं। DKC रोगियों myelodysplastic सिंड्रोम से ग्रस्त हैं और घातक श्लैष्मिक अर्बुद की एक वृद्धि की व्यापकता है। इस प्रकार, मानव रोगियों में टेलोमिरेज की कमी देर पीढ़ी टेलोमिरेज पीटा चूहों में मनाया जाता है कि स्टेम सेल कार्यों और ट्यूमर गड़बड़ी के दोषों का स्मरण दिलाता है।
लघु telomeres और उच्च टेलोमिरेज गतिविधि कैंसर की पहचान कर रहे हैं। सामान्य या premalignant कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, डीएनए डबल असहाय-विराम (DSBs) 13 से उकसाया उन लोगों के समान telomeres और सेलुलर चौकियों की सक्रियता के अंतिम कटाव में कम या अनुपस्थित टेलोमिरेज गतिविधि का परिणाम है। शास्त्रीय DSBs की तरह, टेलोमेर शिथिलता ऐसे वार्धक्य और / या apoptosi के रूप में सेलुलर प्रतिक्रियाओं, p53 के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है और संबद्ध किया गया है14,15 है। P53 के उत्परिवर्तनीय निष्क्रियता पर, सेल साइकिल चलाना और सेल अस्तित्व ट्रांसलोकेशन और क्षेत्रीय amplifications और विलोपन 16,17 द्वारा विशेषता एक समर्थक कैंसर mutator तंत्र प्रदान करता है जो टेलोमेर रोग, के साथ कोशिकाओं में बढ़ा रहे हैं। इसी समय, टेलोमेर शिथिलता और (यहां तक कि p53 अशक्त कोशिकाओं में) जुड़े अनियंत्रित गुणसूत्र अस्थिरता जारी रखा इस तरह के कैंसर का पूरा घातक प्रगति विवश करने के लिए दिखाई देते हैं। उदाहरण के लिए, देर पीढ़ी जी -4-g5 के mTERC – / – Ink4a / एआरएफ – / – चूहों की वजह से टेलोमेर उदासीनता को Ink4a / एआरएफ अशक्त चूहों के साथ तुलना में काफी कम लिंफोमा घटनाओं से पता चला है। एक अन्य अध्ययन में, जी -4 mTERT में और अधिक उन्नत एडिनोमेटस घावों – / – एपीसी मिनट चूहों बहुत की वजह से महत्वपूर्ण वृद्धि की गिरफ्तारी और apoptosis 18,19 को एपीसी मिनट चूहों के साथ तुलना में दबा दिया गया।टेलोमेर जीनोमिक अस्थिरता शिथिलता प्रेरित अवलोकन है कि ट्यूमर प्रगति टेलोमिरेज की सक्रियता कैंसर सेल व्यवहार्यता और / या निष्क्रिय p53 के आश्रित या स्वतंत्र जांच की चौकी तंत्र के साथ संगत स्तर तक जीनोमिक अस्थिरता शमन के हिस्से में घातक प्रगति सक्षम हो सकता है कि अटकलों का संकेत देता है रोकता।
टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन रोकने के लिए या यहां तक कि स्टेम कोशिकाओं की उम्र बढ़ने रिवर्स, और टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि के खिलाफ tumorigenesis बढ़ावा कर सकते हैं कि क्या कर सकते हैं कि क्या अध्ययन करने के क्रम में, हम दो inducible murine टेलोमिरेज एलील उत्पन्न। पहले एक चार-Hydroxytamoxifen है (4-OHT) -inducible TERT-एस्ट्रोजन रिसेप्टर (mTERT-ईआर) फ्यूजन तोड़े में एलील। 4-OHT के अभाव में, mTERT-ईआर (नामित mTERT ईआर / ईआर) के लिए समयुग्मक चूहों टेलोमिरेज गतिविधि की कमी कर रहे हैं और पारंपरिक mTERT या एम के रूप में ही सितोगेनिक क और सेलुलर phenotypes को बनाए रखनेTERC पीटकर मॉडल। 4-OHT उपचार करने पर, TERT-ईआर प्रोटीन गतिविधि देशी TERT प्रोटीन 20, 21 के लिए तुलनीय स्तर को बहाल किया जा सकता है। दूसरे एलील एक उपन्यास inducible TERT तोड़े में एक intronic LoxP डाट-LoxP कैसेट युक्त एलील (LSL- है mTERT); LSL के छांटना Cre की मध्यस्थता पर, mTERT अंतर्जात अभिव्यक्ति नियंत्रण तंत्र 22 के तहत फिर से व्यक्त किया जाता है।
यहाँ, हम दो inducible murine टेलोमिरेज एलील और कैसे vivo में इन विट्रो में टेलोमिरेज पुन: सक्रिय करने की पीढ़ी की रिपोर्ट। mTERT-ईआर गतिविधि के फिर सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण कदम टेमोक्सीफेन की एक सतत एकाग्रता रखने के लिए है, इसलिए हम अमेरिका के इनोवेटिव रिसर्च द्वारा निर्मित 4-OHT समय रिलीज छर्रों का उपयोग करने के लिए चुनते हैं। छर्रों अप करने के लिए 60 दिनों के लिए एक एनजी / एमएल के एक स्थिर राज्य रक्त स्तर पर 4OHT रिहा रहते हैं। पिछले एक अध्ययन में, हम इस रणनीति के साथ टेलोमिरेज गतिविधि के फिर सक्रिय ऐसे स्टेम सेल थकावट, जी -4 mTERT ईआर / ईआर में टेलोमेर शिथिलता द्वारा प्रेरित किया गया है कि कई अंगों में ऊतक चोट प्रतिक्रियाएं और अंग विफलता की हानि के रूप में अपक्षयी phenotypes के उन्नति करने में सक्षम था कि पता चला चूहों 20।
बुढ़ापे में टेलोमिरेज के समारोह का अध्ययन करने के अलावा, इन दो inducible टेलोमिरेज एलील भी कैंसर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों में ले लियाइन एलील का लाभ जीनोम को आकार देने और टी सेल Thymic लिंफोमा 21 और प्रोस्टेट कैंसर के 22 के जीव विज्ञान को प्रभावित करने में टेलोमेर उदासीनता और टेलोमिरेज पुनर्सक्रियन की भूमिका का पता लगाने के लिए। इन दोनों के अध्ययन से पता चला है कि देर पीढ़ी जी -4 एटीएम में टेलोमेर शिथिलता – / – mTERT ईआर / ईआर और जी -4 पंजाब-Cre4 PTEN एल / एल p53 एल / एल LSL-mTERT एल / एल चूहों के लिए जल्दी mutagenic घटनाओं के अधिग्रहण के ईंधन भरने के लिए एक तंत्र प्रदान करता है ट्यूमर दीक्षा, अभी तक पूरी तरह से घातक ट्यूमर को बढ़ने से रोकता है। टेलोमिरेज टेलोमेर शिथिलता प्रेरित जीनोमिक अस्थिरता, डीएनए की क्षति चौकियों और अनियंत्रित गुणसूत्र अस्थिरता के संदर्भ में पुन: सक्रिय हो गया था जब इस तरह के प्रोस्टेट कैंसर के 21 की हड्डी मेटास्टेसिस और thymi के मस्तिष्क घुसपैठ के रूप में नए जैविक गुणों के साथ घातक ट्यूमर का पूरा प्रगति की अनुमति दी है, जो दबा दिया गयासी लिंफोमा 21। इसी प्रकार घटनाएं भी पेट के कैंसर और अग्नाशय के कैंसर (डीआरएस। Haoqiang यिंग, एडम Boutin और रोनाल्ड DePinho के साथ व्यक्तिगत संचार) सहित अन्य प्रकार के कैंसर में मनाया गया।
TERT-ईआर प्रोटीन आसानी से जानवरों टेमोक्सीफेन या वाहन के साथ व्यवहार कर रहे हैं, इस पर निर्भर राज्यों पर बीच और बंद toggled जा सकता है, क्योंकि mTERT-ईआर एलील द्वारा उत्पन्न ट्यूमर मॉडल विरोधी टेलोमिरेज चिकित्सा परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। पिछले अध्ययन में, ट्यूमर जी -4 एटीएम में उत्पन्न – / – mTERT ईआर / ईआर जानवरों 4-OHT से जारी किए गए; टेलोमिरेज कमी पर, ट्यूमर की वजह से आखिरकार टेलोमेर शिथिलता प्रेरित चौकियों 21 की बहाली के लिए सिकुड़ गया। हालांकि, जवाब में प्रतिरोध का अधिग्रहण ट्यूमर के कुछ Telomeres (एएलटी) तंत्र का एक वैकल्पिक लंबी सक्रिय द्वारा विलुप्त होने टेलोमिरेज करने के लिए। इन Alt + प्रतिरोधी ट्यूमर के आगे लक्षण वर्णन है कि टी पता चलाअरे माइटोकॉन्ड्रियल संश्लेषण और oxidative रक्षा PGC-1β के एक मास्टर नियामक सहित माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान और oxidative रक्षा में शामिल जीनों की न्यायपालिका प्रतिलेखन है। टेलोमिरेज + ट्यूमर कोशिकाओं को 21 अपेक्षाकृत बरकरार रहेगा रखने जबकि PGC-1β या SOD2 (ऑक्सीडेटिव रक्षा का एक और नियामक) की पछाड़ना काफी Alt + ट्यूमर कोशिकाओं को समाप्त।
इन दो तोड़े में alleles की एक सीमा है कि वे टेलोमिरेज जीन के जन्म का ठिकाना में हैं, क्योंकि वे केवल अंतर्जात स्तर पर टेलोमिरेज के पुनर्सक्रियन बर्दाश्त कर सकते हैं। सबसे अधिक मानव में कैंसर, टेलोमिरेज वास्तव में एक बहुत उच्च स्तर पर overexpressed है। टेलोमिरेज के स्तर को बढ़ाने के क्रम में, हम विचार कर सकते हैं एक संशोधन ऐसे Rosa26 ठिकाना में PGK (phosphoglycerate काइनेज) के प्रमोटर के रूप में एक मजबूत प्रमोटर के साथ mTERT-ईआर निर्माण डालने के लिए है।
अंत में, इन दो उपन्यास inducible murine टेलोमिरेज alleles के अभूतपूर्व गेनेट प्रदान करते हैंआईसी उपकरण विशेष रूप से पूर्व अधिग्रहीत टेलोमेर शिथिलता प्रेरित जीनोमिक अस्थिरता की पृष्ठभूमि के तहत, उम्र बढ़ने और ऊतक homeostasis के साथ ही ट्यूमर प्रगति में टेलोमिरेज के कार्यों का अध्ययन करने के लिए। mTERT-ईआर एलील भी अन्य ट्यूमर होने का खतरा माउस मॉडल में पार करके विरोधी टेलोमिरेज चिकित्सा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).
Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
HBSS | Life technologies | 14025092 | |
PBS | Life technologies | 10010023 | |
xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
rubber cement | Walmart | Elmer's | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |