Целью этого протокола является изучение опухолегенеза молочной железы. С помощью этой методики удаляются опухоли молочной железы мышей и из опухолей подготавливаются первичные клетки. Протокол экстракции легких включает в себя протокол экстракции легких для изучения метастазов в легких. Кроме того, включен еще один протокол анализа эмбриональных фибробластов мыши из эмбриона мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Первичная опухоль и MEF Выделение клеток для изучения метастазов в легких
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
При опухолеобразовании молочной железы метастатическая стадия заболевания представляет наибольшую угрозу для пораженного человека. Нормальные клетки молочной железы с измененными генотипами теперь обладают способностью проникать и выживать в других тканях. В этом протоколе удаляются опухоли молочной железы мыши и из опухолей подготавливаются первичные клетки. Клетки, выделенные в результате этой процедуры, затем доступны для экспериментов по профилированию генов. Для успешного метастазирования эти клетки должны быть способны к интравазии, выживанию в циркуляции, экстравазации в отдаленные органы и выживанию в этой новой системе органов. Легкие являются типичной мишенью метастазирования рака молочной железы. Был обнаружен набор генов, который опосредует селективность метастазирования в легкие. В данной статье мы опишем метод изучения метастазов в легких на генетически модифицированной мышиной модели. Кроме того, включен еще один протокол анализа эмбриональных фибробластов (MEF) мыши из эмбриона мыши. MEF-клетки одного и того же животного типа дают ключ к разгадке экспрессии генов нераковых клеток. Вместе эти методы полезны для изучения опухолевого генеза молочной железы у мышей, связанных с ним сигнальных механизмов и путей аномалий у эмбрионов.
Введение
Метастазирование является последним шагом в прогрессировании рака молочной железы 1. Он включает в себя ряд этапов, в ходе которых злокачественные клетки высвобождаются из первичной опухоли и диссеминируются в другие органы. Клетки должны быть способны к интравазии, выживанию в циркуляции, экстравазации в отдаленные органы и выживанию в этой новой системе органов. Каждый этап онкогенеза жестко контролируется клетками посредством различных генетических и эпигенетических изменений 4. Для изучения механизмов онкогенеза рака молочной железы были использованы мышиные модельные системы из-за их короткой продолжительности жизни, не....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты были мыши осуществляется в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональные животных уходу и использованию комитетов (IACUC) в ЛГУ в Школе медицины. Все инструменты должны быть в автоклаве до вскрытия.
1. Подготовка первичных клеток из опухоли молочной железы мыши
- Используйте модель мыши, которая была генной инженерии с помощью мыши опухоли молочной полиомавируса Средний Т-антигена (ВОМЖМ-PyMT-трансгенной мыши), которые самопроизвольно развития опухоли, как описано ранее 6.
- Жертвовать мышей Isoflurane (99,9%) и спрей 75% этанола, чтобы обеспечить стерильную среду (фиг.1А).
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этап опухолевой прогрессии, при котором в жертву животное, зависит от конкретного исследования и принципов IACUC. На рисунке 1А, 100-дневного возраста C57BL / 6 мыши с мышь опухоли молочной полиомавируса Средний Т-антигена (ВОМЖМ-PyMT) был принесен в жертву на три месяца. Кожа была открыта из области отверстия мочеиспускательного канала к шее с ножницами и кожа была прижата для обеспечения легкого доступа к органам, как показано на рисунке 1В. Это позволило легкий доступ к опухоли, кото.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол для выделения первичных клеток из свежей опухоли мыши. Лизаты получают из этого метода могут быть использованы для белка, ДНК и РНК анализа. Раковые клетки опухоли молочной железы первичной часто метастазируют в мозг, легкие и кости 1. В комплекте есть метод для извлечения легких для выявления метастазов. Окрашивание легких с чернилами пятна позволит визуализации опухолевых узелков, как показано на рисунке 2В. Крепление легкие в Z-Fix решения позволит нам сделать разделы легких,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют раскрытия.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить NIH, LACaTS и фонд клиники Ochsner за финансовую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Магазин в 4 ° C |
| 0,05% Трипсин-ЭДТА | Life технологии | 25300-062 | Хранить в – 20 ° C |
| коллагеназа типа IV | Sigma-Aldrich | C5138 | хранить в – 20 ° C |
| гиалуронидаза | сигма-олдрич | H3506 | хранить в – 20 ° C |
| Pen Strep | Life технологии | 15140-122 | Магазин по адресу 4° |
| C Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 ° C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Магазин в RT |
| India Ink | Yasutomo | Магазин в RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Магазин в RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Магазин в RT |
Ссылки
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
