Lepr<sup> DB</sup> 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
2 형 당뇨병은 2013 년 382,000,000명에 영향을 미치는 만성 질환이며, 지난 2 년 동안. 2035 1 592000000에 명확하게이 설립 된 제 2 형 당뇨병에서 베타 세포 기능 장애의 역할을 증가 할 것으로 예상된다. 연구 진행은 췌장 섬의 분리 방법을 요구하고있다. 섬 분리의 프로토콜은 야생형과 당뇨병 Lepr의 데시벨 (dB / DB) 마우스 모두에서 고립 된 섬의 수율과 품질을 개선하기 위해 일부 수정과 함께 공유 여기 다른 그룹의 프로토콜과 많은 일반적인 단계를 제시했다. 라이브 셀 2 광자 이미징 법은 아일렛 내에서 인슐린 분비의 조절을 조사하기 위하여 사용될 수 제시된다.
Introduction
질병의 베타 – 세포 기능 부전의 역할은 광범위 3,4-을 인식하고있다. 이러한 MIN6와 INS-1 등의 세포주는 베타 세포 행동의 생물학을 이해하기 위해 유용한 도구이다. 그러나, 인슐린 분비의 생리적 제어는 랑게르한스의 섬 내에서 일어난다. 이 섬은 단단히 포장 베타 세포의 수천뿐만 아니라 혈관 및 기타 내분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 아일렛이 환경 내의 인슐린 분비에 영향을 당뇨병에 중요한 것으로 예상된다. 따라서, 인슐린 분비의 생리 학적 제어하고 질환의 병태 생리를 이해하기 위해서는 본래 아일렛을 연구하는 것이 필수적이다.
섬 격리
2 형 당뇨병 환자, 특히 인간의 아일렛 라이브 인간 섬과는 얻는 것이 곤란하다. 또한, 인간의 독도 실험 분자 조작에 대한 제한 가능성이 있습니다. 연구원은 그러므로 고용 한동물과 제 2 형 당뇨병 동물 모델에서 할 수 있습니다. 하나는 이러한 질병 모델은 DB / DB 마우스입니다. 이 모델은 밀접하게 인간의 질병 5,6 평행 표현형의 진행과 2 형 당뇨병 자발적인 돌연변이입니다. 당뇨병 DB / db 마우스에서 섬의 격리를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 더 나은 수율, 정화 및 강화 섬의 생존을위한 몇 가지 정련 다른 그룹과 공통점이 많은 단계가 있습니다.
2 광자 이미징
여기에 설명 된 라이브 셀 2 광자 분석법을 계량 숫자 7과 야생형 당뇨병은 8,9 아일렛의 많은 세포로부터 인슐린 단일 – 함유 과립의 특성을 평가하기 위해 연구를 가능하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
아일렛 분리에 가장 중요한 요인은 췌장의 초기 관류이고; 아래는 상당히 낮은 섬 수율 췌장 결과를 관류. 다른 인자는 또한 소화 시간 부분적 관류의 레벨을 보정 할 수 진탕 레벨로 분리 품질에 영향을 미친다. 예를 들어, 완전히 관류 췌장 부드럽게 진탕하면서 아래에서 췌장 세게 진탕 ~ 20 분 소화가 필요할 수 소화 반대로, 18 분 30 초 ~ 37 ° C에서 배양해야한다. 우리의 손에 두 개의 소화 효소?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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