चूहे में ठंड संवेदनशीलता और अनुकूलन के निर्धारण के लिए एक सरल और सस्ता तरीका
Summary
The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.
Abstract
Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.
Introduction
कृन्तकों में ठंड जवाबदेही मापने दोनों सामान्य और रोग की शर्तों के तहत मानव में ठंड संवेदनशीलता के संभावित तंत्र की समझ में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। शीत तल परख (सीपीए), मूल रूप से पहले एक कई साल, आरटी पर दिया ठंड प्रोत्साहन के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्पष्ट murine व्यवहार प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है विकसित की है। इस परख की और हाल ही में संवर्द्धन तापमान दो की एक विस्तृत श्रृंखला में ठंड संवेदनशीलता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप की अनुमति दी है। दोनों संस्करणों की भी अपेक्षाकृत उच्च throughput, और उपयोग करने के लिए सस्ती होने के लिए तैयार कर रहे हैं।
प्रगति का एक बड़ा सौदा अन्य व्यवहार तरीकों का उपयोग कर ठंड संवेदनशीलता के तंत्र को समझने में किया गया है। एक विधि dabbing या माउस पंजा पर एसीटोन छिड़काव और माउस पंजा 3,4 flicking खर्च करता है समय की राशि को मापने शामिल है जो एसीटोन वाष्पीकरण परीक्षण है। दुर्भाग्य से,एसीटोन वाष्पीकरण के लिए प्रतिक्रियाओं गीला सनसनी और एसीटोन की गंध से चकित कर रहे हैं। इसके अलावा, एसीटोन वाष्पीकरण की परीक्षा में लागू किया जाता है कि ठंड उत्तेजना लागू किया एसीटोन की मात्रा पर आधारित है, और जिसका अंदाजा लगाना मुश्किल है पर भिन्न हो सकते हैं। अंत में, रिहाई चूहे, आधारभूत में एसीटोन करने के लिए कम से कम प्रतिक्रिया है कि यह असंभव इस विधि के साथ अतिसंवेदनशीलता के अभाव में analgesia के उपाय करने के लिए कर रही है।
ठंड प्रतिक्रियाओं के लिए एक और शास्त्रीय परख पूंछ ठंडे पानी 5,6 में डूब जाता है के बाद वापसी के लिए विलंबता मापा जाता है जहां पूंछ झटका परख है। इस परख में व्यवहार प्रतिक्रियाओं स्पष्ट कर रहे हैं और परख के लिए एक विशिष्ट तापमान के लिए प्रतिक्रियाओं के उपाय करते हैं, जानवरों के साथ अच्छी तरह से वर्णित तनाव प्रेरित एनाल्जेसिक तंत्र 7 के माध्यम से ठंड जवाबदेही को बदल सकते हैं, जो परीक्षण के दौरान रोका जाना चाहिए।
एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरण व्यवहार जो उपाय ठंड प्लेट परीक्षण है,चूहों की प्रतिक्रियाएं वे एक Peltier ठंडा प्लेट 8-10 पर रखा जाता है के बाद। इस उपकरण विशिष्ट तापमान पर पशु प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है, यह भी असंगत इस्तेमाल किया गया है; विभिन्न समूहों कूदता 8,11 की संख्या, पहली प्रतिक्रिया 8,11- से 13 विलंबता सहित प्रतिक्रियाओं के विभिन्न प्रकार मापा है, और पंजा की संख्या बहुत अलग परिणामों के साथ 11,13,14 हटाया। ठंड प्लेट परख भी एक समय में परीक्षण किया जा सकता है केवल एक पशु के रूप में अपेक्षाकृत कम throughput है, और यह एक महंगी और नाजुक Peltier डिवाइस की आवश्यकता है।
2-प्लेट तापमान वरीयता परीक्षण जानवरों अलग तापमान 9,15- 17 में से 2 जुड़े प्लेटों पर खर्च करते हैं कि समय के रिश्तेदार राशि उपाय है कि ठंड प्लेट परीक्षण का आमतौर पर इस्तेमाल किया व्युत्पन्न है। इसी तरह एक अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया परख थर्मल ढाल परख, चूहों अलग तापमान क्षेत्रों में खर्च करते हैं उस समय की है, जहां राशि हैएक लंबी धातु की थाली पर 5 डिग्री सेल्सियस और 45 डिग्री सेल्सियस के बीच लेकर 16 मापा जाता है। इन assays तापमान की तुलना की अनुमति है, यह व्यवहार तापमान घृणा या तापमान पसंद करने का प्रतिनिधित्व करता है कि क्या यह स्पष्ट नहीं है।
अंत में, गतिशील ठंड प्लेट परख चूहों परिवेश तापमान 18 बदलने के लिए प्रतिक्रिया कैसे को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस पद्धति का एक आर टी Peltier डिवाइस पर चूहों रखने और चूहों कूद या अलग प्लेट तापमान पर अपने पंजे चाटना कितना मापने, जबकि एक डिग्री सेल्सियस के लिए इसे नीचे ramping शामिल है। इस चूहों एक शीतलन पर्यावरण के लिए अनुकूल कैसे परीक्षण करती है, यह चूहों एक कूलर परिवेश के तापमान की सेटिंग में एक ठंड उत्तेजना का जवाब कैसे परीक्षण करने के लिए एक तरीका प्रदान नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शन करने के लिए महंगे उपकरण की आवश्यकता है और उनके ठंड संवेदनशीलता को मापने से पहले परीक्षण उपकरणों के लिए चूहों acclimate करने के लिए एक तरीका प्रदान नहीं करता है।
इन assays के पूरक हैं, सीपीए acclima testsतापमान पर्वतमाला की एक किस्म पर एक अच्छी तरह से परिभाषित ठंड प्रोत्साहन के लिए टेड प्रतिक्रियाओं, या ठंडे तापमान परिवेश के लिए अनुकूल करने की प्रक्रिया के दौरान। यह सस्ते में उच्च throughput परीक्षण के लिए बढ़ाया जा करने की क्षमता के साथ, हमारे वर्तमान तंत्र के साथ एक समय में 14 चूहों को जांच कर सकता।
Protocol
Representative Results
Discussion
The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T-type thermocouple probe | Physitemp | IT-24p | Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/) |
| Glass plate | Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) | N/A | We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful |
| Thermal Data logger | Extech | EA15 | Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408) |
| 3mL Syringe | BD | 309657 | The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe |
| Computer | If using Extech logger, any Pcwill work | N/A | |
| Aluminum boxes | Washington University in St. Louis machine shop | N/A | boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid. There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water. |
| Heated water circulator | VWR | Any water circulator model with a pump will work | |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | The exact needle size is not important |
| Hand timer | N/A | Any hand timer will work | |
| Mirror | N/A | Any flat mirror will work |
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