En enkel og rimelig metode for å bestemme Cold Følsomhet og Adaptation i Mus

Summary

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Abstract

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.

Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.

This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Introduction

Måling kald respons hos gnagere er viktig for å øke forståelsen av de potensielle mekanismer for kaldt følsomhet hos mennesker under begge normale og patologiske tilstander. Den kalde plantar Assay (CPA), som opprinnelig ble utviklet for noen år siden ^en er utformet for å generere reproduserbare, entydige murine atferdsmessige respons til en kald stimulus levert ved RT. Flere nylige forbedringer av denne analysen har tillatt reproduserbar måling av kaldt følsomhet ved et vidt temperaturområde ^2. Begge varianter er også utformet for å være forholdsvis høy gjennomstrømning, og billig å bruke.

En stor del av det er gjort framskritt i å forstå mekanismene for kaldt følsomhet med andre atferds metoder. En metode er aceton fordampning test, som innebærer dabbing eller sprøyting aceton på musen labben og måling av mengden av tid som musen bruker på å smekke labben ^3,4. Dessverre,svarene på aceton fordampning blir forvirret av den våte følelsen og lukten av aceton. Dessuten kan den kalde stimulus som blir anvendt i aceton fordampning test variere basert på mengden av anvendt aceton, og det er vanskelig å kvantifisere. Endelig uskadde mus har minimal respons på aceton ved baseline, noe som gjør det umulig å måle analgesi i fravær av overfølsomhet med denne metoden.

En annen klassisk analyse for kalde responser er halen flick assay, hvor ventetid til uttak måles etter at halen er nedsenket i kaldt vann ^5,6. Mens de atferdsmessige responser i denne analysen er entydige og analysen måler svar på en bestemt temperatur, må dyrene være tilbakeholdne under testing, noe som kan endre kald respons gjennom godt beskrevet stressrelaterte smertestillende mekanismer ^7.

En annen vanlig brukt verktøy er kald plate test som måler atferdsresponser hos mus etter at de er plassert på en Peltier-avkjølt plate ^8-10. Mens dette verktøyet gir informasjon om dyre svar på bestemte temperaturer, har det også blitt inkonsekvent brukt; ulike grupper har målt ulike typer tiltak, inkludert antall hopp ^8,11, ventetid til første reaksjon ^{8,11- 13,} og antall labb løfter ^11,13,14 med svært forskjellige resultater. Den kalde plate assay er også relativt lav gjennomstrømning som bare ett dyr kan testes på en gang, og det krever en kostbar og skjør Peltier-enhet.

Den 2-plate temperatur preferanse test er en ofte brukt derivat av den kalde plate test som måler den relative mengden av tid som dyr bruker på 2 sammenhengende plater av forskjellige temperaturer ^{9,15- 17.} En annen lignende som vanligvis brukes assay er den termiske gradient assay, hvor den tid som mus tilbringer i ulike temperatursonersom varierer mellom 5 ° C og 45 ° C på en lang metallplate blir målt ^16. Mens disse analysene tillate sammenligning av temperaturer, er det uklart om atferden representerer temperatur aversjon eller til temperatur preferanse.

Endelig har det dynamiske kald plate assay blitt brukt til å måle hvor musene reagere på endringer i omgivelsestemperaturer ^18. Denne metoden innebærer å plassere mus på en RT peltier-enhet og ramping det ned til 1 ° C mens måle hvor mye mus hoppe eller slikke sine poter på forskjellige plate temperaturer. Mens dette tester hvordan mus tilpasse seg en avkjølende miljø, gir den ikke en måte å teste hvordan mus svare på en kald stimulans i innstillingen av en kjøligere temperatur. I tillegg, det krever dyrt utstyr for å utføre og gir ikke en måte å akklimatisere mus til testing av utstyr før måling sine kalde følsomhet.

For å komplettere disse analysene, tester CPA den acclimated svar på en veldefinert kaldt stimulus på en rekke temperaturområder, eller i løpet av prosessen med å tilpasse seg kalde temperaturer. Det kan teste opp til 14 mus i en tid med de nåværende apparater, med mulighet for å bli billig skalert opp for high-throughput testing.

Protocol

Alle muse protokoller var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Animal Studies Committee of Washington University School of Medicine (St. Louis, Missouri). 1. Klar Testing Plate og kabinetter Rengjøre av glassflaten. Sikre T-type filament termo sonden til overflaten i midten av den glassplate med laboratoriebånd. Plasser dyret vedlegg på glassplaten i en enkelt linje langs midten av platen. Tråd termokobling…

Representative Results

De atferdsrespons oppnådd fra mus som starter ved 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C og 12 ° C er meget reproduserbar (figur 4A) 20. For å måle den kalde stimulus blir generert under bakpote, ble musene bedøvet med en ketamin / xylazin / acepromazin cocktail og potene ble sikret på glass på toppen av en T-type filament termo (Figur 4B) 20. Glasset ble avkjølt eller oppvarmet til den ønskede testområdet. Selv om platen avkjøles jevnt langs lengden av platen <stron…

Discussion

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation¹, neuropathic injury¹, analgesics¹, genetic knockouts²⁰, and ge…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T-type thermocouple probe	Physitemp	IT-24p	Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate	Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)	N/A	We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger	Extech	EA15	Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3mL Syringe	BD	309657	The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer	If using Extech logger, any Pcwill work	N/A
Aluminum boxes	Washington University in St. Louis machine shop	N/A	boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator	VWR		Any water circulator model with a pump will work
21 gauge needle	BD	305165	The exact needle size is not important
Hand timer	N/A		Any hand timer will work
Mirror	N/A		Any flat mirror will work