This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन (IFN) सभी रीढ़ एक में वायरस और अन्य रोगजनक उत्तेजनाओं और पेश करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण हैं। प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का जवाब करने के लिए, IFN 2 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, एक्सप्रेस और छिपाना। ऐसे टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLR), डंक, और रिग-मैं के रूप में सहज प्रतिरक्षा सेंसर, रोगाणु जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) 3,4 का पता लगाने पर प्रकार मैं और तृतीय IFN अभिव्यक्ति प्रेरित। इंसानों में, मैं IFN प्रकार 2,5 जटिल IFNAR1 / IFNAR2 रिसेप्टर को IFN-β, -ω, -κ, और IFN-α के 12 उपप्रकार है, और बाँध शामिल हैं। प्रकार III IFN IFN-λ1, -λ2, और -λ3 में शामिल हैं और IL10RB / IL28RA रिसेप्टर जटिल 2 करने के लिए बाध्य। माइल्ड, प्रकार मैं और तृतीय IFN तो STAT1 / STAT2 heterodimers भर्ती और इंटरफेरॉन प्रेरित जीन (ISG) 6 का प्रतिलेखन आरंभ जो उनके संबंधित रिसेप्टर परिसरों को बाँध। ISG एंटीवायरल और एंटी से, कार्यों की एक विविध रेंज में शामिल कर रहे हैंअनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 7 के सक्रियण के लिए proliferative गतिविधि।
रोगज़नक़ों, बचना नाश, और IFN संकेतन मार्ग के तत्वों का अपहरण करने के लिए विकसित किया है कई तंत्र सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 8 में IFN के महत्व को प्रदर्शित करता है। उदाहरण के लिए, चेचक वायरस एक Yaba-जैसे रोग वायरस मैं और तृतीय IFN प्रोटीन 10 टाइप रोकता है कि एक ग्लाइकोप्रोटीन स्रावित करता है, जबकि मैं 9 IFN टाइप sequesters कि IFNAR1 अनुरूपता साथ एक फंदा रिसेप्टर व्यक्त करता है। मेजबान बचाव में उनकी भूमिका के अलावा, IFN भी कैंसर निगरानी और ऑटो भड़काऊ रोगों की संख्या में फंसा रहे हैं: स्तन कैंसर की कोशिकाओं में IFN अभिव्यक्ति का मुंह बंद करने immunosurveillance 11 प्रतिबंधित, IFN-α के overproduction प्रणालीगत के विकास में एक तंत्र है एक प्रकार का वृक्ष 12, और डंक से गुमराह सक्रियण डंक से जुड़े Vasculopathy में IFN की अत्यधिक मात्रा के कारण प्रणालीगत सूजन की ओर जाता है13। Therapeutically, IFN मल्टिपल स्क्लेरोसिस 14 के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है, इस तरह के बालों सेल ल्यूकेमिया 18 और पुरानी माईलोजेनस ल्यूकेमिया 19 के रूप में इस तरह के एचबीवी 15 और एचसीवी 16,17, और कैंसर जैसे पुराने वायरल संक्रमण। एक विशेष शारीरिक प्रक्रिया में IFN की प्रासंगिकता के बारे में प्रश्न लगातार इस साइटोकाइन परिवार के सर्वव्यापी प्रकृति प्रकट करते हैं।
विशेष रूप से IFN-α उपप्रकार है, अक्सर एक इकाई 20-23, के रूप में नहीं बल्कि एक निकट से संबंधित का समूह है, लेकिन अलग, प्रोटीन के रूप में माना जाता है कि मैं IFN, टाइप करें। हड्डीवाला विकास 24 के दौरान अस्तित्व और IFN-α उपप्रकार सहित कई IFN प्रजातियों के हठ, इन उपप्रकार के कम से कम एक सबसेट विशिष्ट या अद्वितीय कार्य किया है कि पता चलता है। यह IFN अभिव्यक्ति के निर्णायक पैटर्न को समझने और उपप्रकार 17 में से एक या एक से अधिक के विशिष्ट कार्यों को चिह्नित करने में मदद मिलेगी कि संभव है। टी अध्ययन करने की चुनौतीवह अपने साझा अनुक्रम पहचान पर आधारित है कि मैं और तृतीय IFN उपप्रकार टाइप करें: बारह IFN-α उपप्रकार> 50% से 25 का हिस्सा है और IFN-λ उपप्रकार उनके एमिनो एसिड दृश्यों के 81-96% 26 को साझा करें। वर्णित QRT- पीसीआर परख में, आणविक बीकन (एमबी) और बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) फ्लोरोसेंट जांच अत्यधिक समान IFN उप प्रकार के दृश्यों के बीच एकल आधार जोड़ी मतभेद भेदभाव और IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। परख के 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप क्रमशः प्रतिलेख प्रतिलिपि संख्या और ΔCq द्वारा विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, मात्रात्मक (प्रतिलेख मानकों) और अर्द्ध मात्रात्मक (गृह व्यवस्था जीन (HKG)) उपायों दोनों शामिल हैं। प्राइमर / जांच (पीआर / पंजाब) सुखाने के माध्यम से संभव स्वचालित मल्टीचैनल pipetting, और लंबी अवधि के भंडारण, द्वारा सुविधा बैच विधानसभा, परख के reproducibility, उपयोगिता, और व्यावहारिकता में वृद्धि, प्लेटों पर सेट।
इस प्रोटोकॉल प्रक्रिया का वर्णन384 अच्छी तरह से QRT- पीसीआर परख प्लेटें मानव IFN उपप्रकार (1 टेबल) को लक्षित अप करने के लिए सत्रह अलग पीआर / पंजाब सेट के साथ (चित्रा 1) तैयार करने के लिए। पीआर / पंजाब शेयर स्रोत प्लेट (चित्रा 2) एक रोबोट multichannel pipettor का उपयोग स्वचालित किया जा सकता है कि एक प्रक्रिया में एक से अधिक 384 अच्छी तरह से परख प्लेटें तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं काम कर निर्धारित किया है। प्रारंभिक ध्यान मानव IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षर के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल बनाने पर था, वहीं इस विधि के रूप में अच्छी तरह से रीसस मकाक करने के लिए लागू किया गया है। थाली लेआउट थोड़ा अलग हैं और पीआर / पंजाब सेट (तालिका 2) अलग कर रहे हैं, हालांकि, मानव और रीसस प्लेटें बनाने के लिए समग्र तैयारी विधि समान है। प्रोटोकॉल के न्यूनतम संशोधनों के साथ, विधि बारीकी से संबंधित जीन के अन्य समूहों का अध्ययन करने के assays के विकास के लिए अनुमति देने के लिए क्रियान्वित किया जा सकता है।
देखें आंकड़े 1 और नीचे दो
टेबल्स 1 और 2 बेल देखेंओउ
इस रिपोर्ट के डिजाइन, बैच उत्पादन, और एक अनुसंधान प्रयोगशाला स्थापित करने में अत्यधिक समान जीन का एक सेट के प्रतिलेखन को मापने के लिए एक परख का विश्लेषण करने की दिशा में एक दृष्टिकोण का वर्णन है। यहां बताया उच्च throughput QRT- पीसीआर परख IFN- और उपाय – उच्च विशिष्टता के साथ λ उपप्रकार। इस विधि के दो प्रमुख पहलुओं, एक मुताबिक़ जीन परिवार के सदस्यों और पीआर / पंजाब सेट के साथ preloaded विश्वसनीय और लगातार 384 अच्छी तरह से परख प्लेटों के निर्माण के लिए एक उत्पादन मंच के विकास के बीच भेदभाव है कि पीआर / पंजाब सेट की डिजाइन शामिल है। QRT- पीसीआर जांच उनकी विशिष्टता 29 को बढ़ाने की दिशा में एक संरचनात्मक (MB) या रासायनिक (LNA) दृष्टिकोण को शामिल। रीसस परख (तालिका 2) में प्राइमर सेट दोनों के लिए, प्रवर्धन-दुर्दम्य उत्परिवर्तन प्रणाली (हथियारों) आगे विशिष्टता 30 बढ़ाने के लिए प्राइमर दृश्यों में शामिल किया गया था। यह enha को एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों लक्षित करने के लिए आम तौर पर सबसे अच्छा हैप्रकार मैं जीन इंट्रोन्स की कमी IFN क्योंकि एक QRT- पीसीआर प्रतिक्रिया के nce विशिष्टता, यह संभव नहीं था। इसलिए, जीनोमिक डीएनए पीसीआर प्रतिक्रिया में परिलक्षित हो जाएगा, और शाही सेना निकासी के बाद DNase उपचार द्वारा अपमानित किया जाना चाहिए।
पीआर / पंजाब सेट के लिए लक्ष्य क्षेत्र प्रत्येक IFN के लिए परिपक्व पेप्टाइड की कोडिंग क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित किया गया था। क्योंकि IFN-α उपप्रकार, विशेष रूप से परिपक्व पेप्टाइड क्षेत्र के बीच उच्च अनुक्रम समानता के कारण, यह विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए संवेदनशीलता समझौता करने के लिए कभी कभी जरूरी हो गया था। यह विशेष रूप से अन्य IFN-α उपप्रकार के खिलाफ मुकाबले में जब परिपक्व पेप्टाइड प्रतिलेख केवल चार अद्वितीय कुर्सियां है जहां IFN-α17, साथ मामला था। लक्ष्य निर्धारण IFN-α17 जांच करने के लिए विशिष्टता को सीमित, कई उपप्रकार के टेप है कि बाँध प्राइमरों की आवश्यकता है। एक परिणाम के रूप में, पीसीआर प्रतिक्रिया जिससे पीसीआर अभिकर्मकों और Loweri का एक बड़ा प्रतिशत खपत, IFN-α17 के अलावा अन्य उपप्रकार बढ़ाना होगाIFN-α17 के लिए विशेष जांच से प्रतिदीप्ति संकेत के आयाम एनजी। ऐसे IFN के रूप में अत्यधिक समान जीनों के लिए संवेदनशील और विशिष्ट पीआर / पंजाब सेट डिजाइनिंग की दिशा में एक अतिरिक्त चुनौती GenBank डेटाबेस में एनोटेट दृश्यों डिजाइन के समय पर पूर्ण या व्यापक नहीं हो सकता है कि संभावना है। फिर, यह नव एनोटेट दृश्यों को पूरी तरह से डिजाइन की समय डेटाबेस में अनुक्रम के संस्करण के साथ पंक्ति में नहीं है जिसमें IFN-α17 के लिए एक चुनौती थी। पीआर डिजाइनिंग इसलिए, जब / पंजाब गहन अध्ययन नहीं किया गया है कि जीन के लिए सेट है, यह समय समय पर एक लक्ष्य जीन की नवीनतम एनोटेट अनुक्रम जाँच करने के लिए बुद्धिमान है। अंत में, यह जनसंपर्क / पंजाब सेट लिखित लेकिन अनुवाद नहीं किया जा सकता है कि pseudogenes बढ़ाना नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
पीआर / पंजाब सेट डिजाइनिंग के बाद, अगली चुनौती के सत्रह अलग पीआर / पंजाब की पीसीआर शर्तों के अनुकूलन है एक 384 अच्छी तरह से थाली पर सेट। ट्रांसक्रिप्ट मानकों महत्वपूर्ण हैंएक पीआर / पंजाब सेट की विशिष्टता का परीक्षण और कई अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं का QRT- पीसीआर स्थितियों में तालमेल के लिए आवश्यक हो गया में उग्रवादी। प्रतिलेख मानकों के खिलाफ एक पीआर / पंजाब सेट का परीक्षण कर अपनी क्षमता और संवेदनशीलता स्थापित करता है; अत्यधिक समान pseudogenes व्यक्त कि प्लास्मिड सेट पीआर / पंजाब चुनिंदा कार्यात्मक जीन का प्रतिलेखन कि उपायों को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। प्रतिलेख मानकों को भी एक गृह व्यवस्था जीन (ΔCq) करने के लिए अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण रिश्तेदार के अलावा, विश्लेषण का एक मात्रात्मक साधन (टेप की संख्या) प्रदान करते हैं।
एकाधिक 384 अच्छी तरह से परख प्लेटों में एक 96 अच्छी तरह से स्रोत थाली से रोबोट मल्टीचैनल pipetting के सटीक और अंतर-प्लेट परिणामों की स्थिरता में सुधार। करता प्लेटों में तिरस्कृत अभिकर्मकों सुखाने के रूप में सामन शुक्राणु डीएनए (ssDNA), स्थिर और लंबी अवधि के भंडारण के लिए पीआर / पंजाब सेट को बरकरार रखता है कि एक कैरियर के रूप में प्रयोग किया जाता है। प्लेटें सुखाने भी प्रतिक्रिया की मात्रा कम हो जाती हैबदले में कीमती नमूनों को बरकरार रखता है और महंगा अभिकर्मकों का उपयोग कम हो जाती है, जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए आवश्यक है। इन कदमों के माध्यम से, प्लेटों के बैच अधिक से अधिक छह महीने के लिए सटीक और स्थिरता प्रदान कि इकट्ठा कर रहे हैं।
प्लेट तैयार करने के बाद, गुणवत्ता नियंत्रण उपायों प्लेटों के एक बैच की निरंतरता की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रयोजन के लिए मानकों का एक अतिरिक्त चार सेट एक थाली पर चलाए जा रहे हैं। "5x मानक" थाली प्रदर्शन पटरियों और एक व्यक्ति की थाली के मानकों की तुलना में कर रहे हैं, जो करने के लिए एक डाटा सेट बनाता है। प्रत्येक मानक के दस दस गुना dilutions परख डिजाइन के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं, जबकि अंतरिक्ष विचारों चार अंक प्रत्येक परख थाली पर मानक वक्र के लिए प्रयोग किया जाता है, और 5x मानक प्लेट के लिए कर रहे हैं कि आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, एक सकारात्मक नियंत्रण प्लेट की वैधता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक थाली पर शामिल किया जाना चाहिए।
आमतौर पर, यह जनसंपर्क / पंजाब के एक से छह परख प्लेटें तैयार करने के लिए 3-4 घंटे लग जाते हैंस्रोत देखें प्लेट; यह एक अनुसंधान प्रयोगशाला में एक ही दिन में बारह प्लेटें तैयार करने के लिए संभव है। प्रत्येक मानव IFN उप परख थाली सत्रह पीआर / पंजाब सेट की जाँच और पंद्रह प्रयोगात्मक नमूनों को समायोजित कर सकते हैं, विधानसभा के एक दिन 3060 प्रयोगात्मक डेटा बिंदुओं को उत्पन्न करने की क्षमता के साथ प्लेटों की एक बैच पैदा करता है। QRT- पीसीआर मंच से कच्चे डेटा संसाधित और स्वचालित रूप से एक पहले से डिज़ाइन विश्लेषण टेम्पलेट भरने के लिए एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर में प्रोग्रामिंग लिपियों का उपयोग कर इकट्ठा किया जा सकता है। इस विधि के हाथ पर डेटा प्रविष्टि, जिससे रोकने नकल त्रुटियों को कम करता है और अन्वेषक डेटा विश्लेषण के बजाय डेटा विधानसभा पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। यहाँ वर्णित है, इस उच्च throughput QRT- पीसीआर परख मानव या रीसस मकाक नमूनों में इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति को मापने के लिए लागू किया जा सकता है और अन्य प्रजातियों या मुताबिक़ जीन सेट के लिए उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। थाली लेआउट के लचीलेपन उपयोगकर्ता प्राइमर बदलने की अनुमति देता / जांच के जीन दर्जी के लिए सेटएक विशेष सेल प्रकार या मॉडल प्रणाली की ओर ब्याज। यह परख प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल संकेतन तंत्र को स्पष्ट करने के लिए रोगजनकों का अध्ययन सेल संस्कृति मॉडल में या रोग मॉडल के संदर्भ में रोगी के नमूने में IFN अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों को मापने के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम CBER / एफडीए NIAID / एनआईएच Interagency करार यी-ऐ-6153-01, एफडीए / CBER अंदर का धन, और एफडीए मेडिकल Countermeasures इनीशिएटिव द्वारा समर्थित किया गया। TCT, MNB, VPM, एलएमएस, और KDK अमेरिका के ऊर्जा Departmen और अमेरिका के बीच एक interagency समझौते के माध्यम से विज्ञान शिक्षा के लिए ओक रिज संस्थान द्वारा प्रशासित बायोलॉजिक्स मूल्यांकन और अनुसंधान के लिए केंद्र पर रिसर्च भागीदारी कार्यक्रम के लिए एक नियुक्ति के द्वारा समर्थित थे खाद्य एवं औषधि प्रशासन।
0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |