Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Resumen

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Resumen

Analizando las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) cuando son estimuladas con ligandos específicos es fundamental para entender la base de comportamientos-olfativas impulsada y su modulación. Estas propiedades de codificación dependen en gran medida de la interacción inicial entre las moléculas de olor y el receptor olfatorio (OR) expresados ​​en las OSN. El espectro de la identidad, la especificidad y el ligando de la O expresado son críticos. La probabilidad de encontrar el ligando de la O expresado en una OSN elegido al azar dentro del epitelio es muy baja. Para hacer frente a este reto, este protocolo utiliza genéticamente ratones etiquetados que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de RUP definidos. OSNs se encuentran en un epitelio apretado y organizada que recubre la cavidad nasal, con las células vecinas influir en su maduración y función. Aquí se describe un método para aislar un epitelio olfatorio intacto y grabar a través de patch-clamp grabaciones las propiedades de OSN correoXpressing receptores de olor definidas. El protocolo permite que uno para caracterizar propiedades de la membrana OSN mientras se mantiene la influencia del tejido vecino. Análisis de los resultados de patch-clamp produce una cuantificación precisa de ligando / O interacciones, las vías de transducción y la farmacología, las propiedades de codificación OSN y de su modulación a nivel de la membrana.

Introducción

Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) representan el primer paso de la percepción olfativa. Situado en el epitelio olfativo que recubre la cavidad nasal en roedores, transforman la información química de los odorantes en los potenciales de acción se ha enviado a través de su axón al cerebro. Para entender mejor los mecanismos de codificación olfativas, es necesario para caracterizar las propiedades de transducción y de membrana de OSN. Hasta hace poco, la mayoría de las técnicas utilizadas para caracterizar las propiedades de OSN mamíferos se llevaron a cabo en disociado OSN ^1-4. El proceso de disociación utiliza varios (es decir, enzimas) proc....

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de cuidado de los animales de la Université de Bourgogne y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Bourgogne.

1. Los animales

1. Utilice ratones O-IRES-tauGFP ingeniería genética disponibles en el Laboratorio Jackson. Estos ratones fueron desarrollados en el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts 'con el fin de analizar la orientación axón y el desarrollo del sistema olfativo ^19. Por ejemplo, la línea MOR23-IRES-tauGFP, código RS 006643, lleva el nombre de la cepa B6 oficial; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; del mismo modo, la línea SR1-IRES-tauGFP, ....

Resultados

El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser cortos (menos de 10 a 15 min) y preciso (es decir, para evitar daños del epitelio). La Figura 1 ilustra cómo una preparación ideal se parece a diferentes niveles de aumento. Con una ampliación baja en campo claro los diferentes tipos de células (tales como perillas de OSN, el apoyo a las células) son distinguibles (Figura 1). En el nivel de ampliación más alta, normalmente 8.......

Discusión

La capacidad de este protocolo para controlar correctamente las propiedades de OSN saludables depende en gran medida de la calidad de la preparación. Por lo tanto, los pasos de disección son críticos. En primer lugar, es crítico que prestar atención a la calidad (pH, osmolaridad), la oxigenación y la temperatura del medio de disección (pero no congelado enfriado con hielo). En segundo lugar, la manipulación del epitelio con herramientas de disección debe ser tan limitado como sea posible para evitar daños. Por último, e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
mesa vibratoria con jaula de Faraday	TMC	63-500 SERIES	requerida : aísla el sistema de grabación de las vibraciones inducidas por el entorno (movimientos del experimentador, vibraciones de equipos como ventiladores para enfriar computadoras, etc.); también se puede comprar con una jaula de Faraday, o equipar con una jaula de Faraday hecha a medida; esta jaula se recomienda para evitar el ruido eléctrico de la
óptica
del entornomicroscopio	Olympus	BX51WI	microscopio vertical equipado con epifluorescencia; platina fija o móvil según la preferencia del usuario
	objetivos Olympus	LUMPLFL40XW	al menos 2 objetivos requeridos: un 4X o 10X para el aproximación aproximada a la célula; y un ejemplo de inmersión de larga distancia 40X Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
lupa	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTAMENTE NECESARIO: colocado en la trayectoria de luz entre el objetivo y la cámara; permite ampliar la imagen en la pantalla para llegar con precisión a la perilla con la cámara de electrodos de grabación
	Olympus	DP72	se requiere una buena cámara para ver las neuronas en fluorescencia así como en campo claro; el software de control es simple y permite tomar fotografías y hacer imágenes de cámara en vivo para monitorear el acercamiento del electrodo a la celda. No es necesaria una cámara ultrasensible
que filtre	Olympus/Chroma		en función de la proteína fluorescente utilizada en los ratones; ejemplo para GFP: excitación: BP460-490: emisión: HQ530/50m
amplificador	HEKA	EPC10 USB	monitorea las corrientes que fluyen a través del electrodo de registro y también controla el soplado enviando una señal TTL al spritzer; la configuración del EPC10 está controlada por
software	informáticoHEKA	Patchmaster	controla el amplificador durante el experimento
micromanipulador	Sutter	MP225	micromanipulador de precisión, permite movimientos precisos de hasta 1/10 de micrómetro; este modelo es muy estable; evite los manipuladores hidráulicos que pueden derivar
extractor de electrodos	Sutter	P97	con un filamento de canal ancho FT345-B;   para preparar pipetas de grabación de aproximadamente 2µ m de diámetro con una punta larga para llegar a las células; la resistencia debe ser de 15 a 20Mohm con solución de abrazadera de parche perforada
vidrio	Sutter	BF120-69-10	en nuestras condiciones de grabación, este vidrio es ideal para registrar pipetas
grabación	Warner Instruments	RC-26G	se necesita una cámara para establecer la preparación bajo el microscopio. Para mantener la preparación en el centro de la cámara, se debe usar una red/ancla.
	WPI	TW100F-4	unido en grupos de 7, estas pipetas se utilizan para preparar pipetas estimulantes pretiradas
extractor multibarril	MDI	PMP-107-Z	por asociación de tracción y torsión, este extractor nos permite preparar electrodos de soplado con inyector de presión de precisión de 7 barriles
	Compañía Toohey	P / N T25-1-900 Un solo canal	este inyector de presión de precisión controla la presión expulsada en el extractor de barriles múltiples; es controlado manualmente o por el amplificador por un 5V
Micromanipulador	Narishige	YOU-1	Un manipulador grueso es suficiente para acercar el electrodo de soplado al lugar de registro
Tubos N	/A		tygon para llevar la presión del puffer a la pipeta de soplado
Soluciones/perfusión/Productos químicos
bomba de vacío	gardner denver	300 series	Una bomba de membrana vibratoria es más silenciosa y eficiente que otros tipos de bombas
sistema de perfusión	N/A	N/A	sistema de perfusión por gravedad con tubo de polietileno para introducir y sacar la solución externa de la cámara de registro
nistatina	Sigma-Aldrich	N3503	obligatorio para perpar solución interna para parche perforado abrazadera de parche
DIMETILSULFÓXIDO	Sigma-Aldrich	D5879	utilizado para disolver la nistatina para la solución interna del parche perforado
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S9625	solución extracelular
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P4504	solución intracelular/extracelular
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma-Aldrich	C7902	solución extracelular
Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	solución extracelular
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	solución extracelular
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	solución extracelular
Bicarbonato de sodio Sigma-Aldrich S6297EGTA (Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético)	Sigma-Aldrich	Solución interna	E3889
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	P1767
solución interna Sulfóxido de metilo	Sigma-Aldrich	W387509	solución intracelular
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389	solución intracelular