संवर्धन मानव जांध की हड्डी ऊतक Explants के लिए तरीके Metastatic आला की स्तन कैंसर कोशिका औपनिवेशीकरण अध्ययन करने के लिए
Summary
प्रोटोकॉल एक मानव हड्डी के ऊतकों explant मॉडल प्रणाली में स्तन कैंसर के सेल प्रवास, प्रसार और उपनिवेशवाद के अध्ययन के लिए वर्णित हैं।
Abstract
अस्थि स्तन कैंसर मेटास्टेसिस का सबसे आम साइट है। यह व्यापक रूप से microenvironment प्रभावों कैंसर सेल व्यवहार स्वीकार किया है कि हालांकि, छोटे से मानव हड्डी के ऊतकों की देशी microenvironment भीतर स्तन कैंसर कोशिका के गुण और व्यवहार के बारे में जाना जाता है। हम ट्रैक, यों और की microenvironment के भीतर मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को व्यवस्थित करना दृष्टिकोण विकसित किया है कुल हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी निम्नलिखित त्याग और्विक सिर से अलग सुसंस्कृत मानव अस्थि ऊतक टुकड़े। स्तन कैंसर की कोशिकाओं luciferase के लिए इंजीनियर और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) अभिव्यक्ति बढ़ाया का उपयोग करना, हम reproducibly के बाद स्तन कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग हड्डी के टुकड़े के भीतर bioluminescence इमेजिंग का उपयोग प्रवास और प्रसार पैटर्न (BLI), ट्रैक सेल बातचीत quantitate, और मूल्यांकन करने में सक्षम हैं फ्लो के साथ बसाना। इस मॉडल की कुंजी लाभ में शामिल हैं: 1) एक देशी, वास्तुकला बरकरार ऊतक microeप्रासंगिक मानव कोशिका प्रकार शामिल हैं, और तेजी से मात्रात्मक और गुणात्मक निगरानी और स्तन और हड्डी सेल गुण, व्यवहार और बातचीत की गड़बड़ी की सुविधा जो microenvironment, 2) सीधी पहुँच कि nvironment। एक प्राथमिक सीमा, वर्तमान में, अल्पकालिक संस्कृति के अध्ययन की खिड़की किनारा जो ऊतक टुकड़े, के परिमित व्यवहार्यता है। मॉडल प्रणाली के आवेदन मेटास्टैटिक आला के भीतर स्तन कैंसर और अन्य हड्डी की मांग दुर्दमताओं के बुनियादी जीव विज्ञान का अध्ययन, और प्रभावी ढंग से हड्डी के ऊतकों में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने में शामिल हैं।
Introduction
ट्यूमर microenvironment व्यापक रूप से स्तन कैंसर की प्रगति और मेटास्टेटिक दौरान कैंसर सेल व्यवहार का एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में मान्यता प्राप्त है 1-3 फैल गया। यहाँ प्रस्तुत पद्धति का लक्ष्य मानव हड्डी के ऊतकों, स्तन कैंसर मेटास्टेसिस 4-6 की सबसे लगातार साइट की microenvironment भीतर स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अध्ययन की सुविधा के लिए है। अस्थि मेटास्टैटिक प्रगति 10,11 में फंसा कोशिकाओं और स्रावित कारकों बंदरगाह, जो दोनों के mineralized और मज्जा डिब्बों 7-9, के शामिल है। व्यापक रूप से विवो माउस मॉडल में इस्तेमाल किया यद्यपि मेटास्टैटिक प्रक्रिया 12-15 के प्रणालीगत अध्ययन की सुविधा, कंकाल के भीतर सेल बातचीत अवलोकन और प्रत्यक्ष गड़बड़ी के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं। अध्ययन और माउस हड्डी के ऊतकों और माउस मज्जा कोशिकाओं संवर्धन के लिए मॉडल प्रणाली बेहतर पहुंच और स्तन कैंसर सेल एम अंतर्निहित कई crosstalk के बारे में अंतर्दृष्टि और तंत्र झुकेंगेmurine कंकाल 16-22 की etastasis। हालांकि, अध्ययन की हड्डी के ऊतकों 23,24 के लिए osteotropism की प्रजाति विशिष्ट पैटर्न वहाँ हो सकता है कि सुझाव दिया है। इन नमूनों की हड्डी की संभावना निर्धारक हैं, जो सभी के निहित प्रजाति विशेष के अस्थि ऊतक गुणों में मतभेद, प्रतिरक्षा की कमी चूहों 11 में बदल अस्थि मज्जा आबादी से उत्पन्न मतभेद, और / या प्रयोगों में इस्तेमाल चूहों के अपेक्षाकृत कम उम्र, प्रतिबिंबित कर सकता है माइक्रोएन्वायरमेंट।
इन विट्रो में आम तौर पर इस तरह के मज्जा व्युत्पन्न अस्थिकोरक या monolayers के रूप में सुसंस्कृत stromal कोशिकाओं के रूप में या इंजीनियर तीन आयामी मॉडल प्रणाली 25-35 के भीतर विशिष्ट हड्डी प्रकार की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है मानव हड्डी सह संस्कृतियों में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए दृष्टिकोण। दो आयामी सेल संस्कृति मॉडल में इन विट्रो का मुख्य आधार का गठन कैंसर अनुसंधान के लिए दृष्टिकोण है, यद्यपि यह लंबे समय तक सेल व्यवहार मौलिक मीटर में बदल दिया है कि मान्यता प्राप्त किया गया हैसंस्कृति प्रणालियों 18,36,37 onolayer। इस matrix- और ऐसे कोलेजन के रूप में प्राकृतिक सामग्री से बना पाड़ आधारित मॉडल सहित तीन आयामी जीवित ऊतकों की जटिलता, कि नकल इंजीनियर microenvironments के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है, या सिंथेटिक पॉलिमर ऊतक की तरह microenvironments बनाने के लिए विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त 36-41। इंजीनियर दृष्टिकोण भी नियंत्रित करने और microenvironment 18,19,41-43 का हार्मोनल परिवेश का अध्ययन करने के बायोरिएक्टर प्लेटफार्मों का उपयोग भी शामिल है। Biomimetic मॉडल और बायोरिएक्टर एक नियंत्रण स्थापित करने में एक जटिल ऊतक microenvironment के कई तत्व प्रदान करते हैं, और सफलतापूर्वक हड्डी 18,19,35,42,43 को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए अग्रिम के लिए लागू किया गया है, इंजीनियर मॉडल प्रणाली आम तौर पर शामिल नहीं है देशी हड्डी पर्यावरण के भीतर मौजूद प्रकार की कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स घटकों का पूरा स्पेक्ट्रम।
अभी हाल तक, स्तन कैंसरकोशिकाओं से मानव हड्डी के ऊतकों की देशी, अक्षत, तीन आयामी microenvironment के भीतर का अध्ययन नहीं किया गया है। हमने हाल ही में (THR) सर्जरी 44 नमूनों कुल हिप रिप्लेसमेंट से अलग मानव अस्थि ऊतक टुकड़े का उपयोग कर एक सह संस्कृति मॉडल के विकास की सूचना दी। इन नमूनों दोनों अल्पकालिक संस्कृति में सूक्ष्म मेटास्टेसिस अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक mineralized और मज्जा डिब्बों बंदरगाह। पिछले काम में हम हड्डी के टुकड़े 44 के साथ (एमडीए MB-231-fLuc) के सह-सुसंस्कृत luciferase व्यक्त स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रसार की निगरानी के लिए bioluminescence इमेजिंग (BLI) प्रयोग करने के लिए सबूत की सिद्धांत की स्थापना की। यहाँ हम मानव अस्थि ऊतक explants का उपयोग कर देशी microenvironment के संदर्भ में स्तन सेल कैंसर प्रसार, उपनिवेशन, और प्रवास के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विस्तृत प्रस्तुत करते हैं।
पहले हम स्तन को मापने के लिए हड्डी के टुकड़े करने के लिए आसन्न सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल पेशBLI का उपयोग करते हुए सेल प्रसार। इस खंड में, स्तन सेल निलंबन हड्डी मोम के टुकड़े से स्थिर हैं, जो हड्डी के टुकड़े, से सटे 6 अच्छी तरह प्लेटें में सेल धब्बे के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। नियंत्रण कुओं हड्डी मोम, लेकिन कोई हड्डी टुकड़ा होते हैं। सेल स्पॉट देते हैं एक बार, मध्यम जोड़ा और प्लेट BLI से मापा जाता है bioluminescent संकेत तीव्रता (सेल नंबर के साथ जुड़े), जिसके बाद 24 घंटा, के लिए सुसंस्कृत है। अगले चरण में हम उपनिवेशवाद और प्रसार का अध्ययन करने के लिए हड्डी के टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं। यहाँ स्तन सेल निलंबन बसाना और सेल नंबर ट्रैक करने के लिए समय के साथ BLI और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृति में निगरानी कर रहे हैं जो अस्थि ऊतक टुकड़े, पर सीधे pipetted हैं। इस विधि में, मज्जा डिब्बे प्रवाह cytometry द्वारा उपनिवेश स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए किसी भी समय बिंदु पर हड्डी के टुकड़े से प्लावित, या मज्जा व्यवहार्यता assays के किया जा सकता है।
इसके अलावा, हम डीस्तन कैंसर के सेल प्रवास को मापने के लिए मुंशी दो अलग अलग दृष्टिकोण। पहली विधि में चरणों की हड्डी के ऊतकों संस्कृति supernatants की ओर प्रवास को मापने के लिए रेखांकित कर रहे हैं। Transwell के भीतरी, ऊपरी सतहों एक 8 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ झिल्ली डालने पर (चित्रा 1 ए में दिखाया गया है) इस प्रोटोकॉल में स्तन कैंसर की कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। सम्मिलित करता है तो हड्डी के ऊतकों पर तैरनेवाला या नियंत्रण मध्यम युक्त कुओं के साथ एक रिसीवर थाली में रखा जाता है। एक 20 घंटा ऊष्मायन अवधि के दौरान, स्तन कैंसर की कोशिकाओं की कम संख्या के नीचे वे BLI द्वारा पता लगाने के लिए देते हैं, जहां कम टिशू कल्चर कुओं में डालने झिल्ली के माध्यम से विस्थापित। दूसरा माइग्रेशन विधि में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को Transwell डालने झिल्ली के निचले, बाहरी सतहों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। , अस्थि ऊतक टुकड़े डालने कप में रखा जाता है और स्तन कैंसर की कोशिकाओं (चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) हड्डी के टुकड़े उपनिवेश स्थापित करने की झिल्ली के माध्यम से ऊपर की ओर पलायन जोतो BLI का उपयोग imaged कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मेहरा एट अल। पहले से उच्च गुणवत्ता वाले ऊतकों खुलासा और मेटास्टैटिक प्रक्रिया 47 अध्ययन करने के लिए मानव हड्डी नमूने के उपयोग को मान्य, शव परीक्षा के समय में काटा मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर रो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इन अध्ययनों से वैकल्पिक अनुसंधान एवं विकास फाउंडेशन (107,588), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1U54CA136465-04S1), और कैलिफोर्निया स्तन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (201B-0141) से अनुदान द्वारा, भाग में, वित्त पोषित किया गया। हम डीआरएस धन्यवाद। के उदार दान के लिए एंड्रयू विल्बर और आर स्कॉट McIvor उनके transponson और पी / hUbiC-SB11 transposase प्लास्मिड। हम कृतज्ञता जॉन Tamaresis, पीएच.डी. स्वीकार करते हैं सांख्यिकीय तरीकों पर सलाह के लिए, टिमोथी ब्राउन प्रवाह cytometry प्रदर्शन के लिए, माइग्रेशन assays के बारे में सलाह के लिए Georgette Henrich, और नैन्सी Bellagamba के लिए THR के नमूनों के संग्रह की सुविधा।
Materials
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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