एक चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर घुसपैठ ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
ट्यूमर microenvironment घुसपैठ कि विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं रसौली के विकास और अस्तित्व को विनियमित। घातक कोशिकाओं टलना या जीवित है और पनपने के क्रम में विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पलट देना चाहिए। ट्यूमर tolerogenic डीसी की भर्ती, प्रतिरक्षादमनकारी विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs), और साइटोटोक्सिक विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बाधित कि माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (MDSC) सहित प्रतिरक्षा के विभिन्न तंत्र के एक नंबर "भागने" का लाभ ले। ट्यूमर दमन में भाग ले सकते हैं सभी immunostimulatory वृक्ष के समान कोशिकाओं, जन्मजात विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के बंदरगाह जो प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, और साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं: इसके विपरीत, विरोधी ट्यूमर प्रेरक प्रतिरक्षा कोशिकाओं कैंसर के विकास और विस्तार धीमा कर सकते हैं। समर्थक और विरोधी ट्यूमर ल्यूकोसाइट्स के बीच संतुलन अंततः व्यवहार और बदल कोशिकाओं के भाग्य निर्धारित करता है; मानव नैदानिक अध्ययन की एक भीड़ इस बाहर वहन किया है। ल्युकोसैट कैंपेन्स के प्रकार, विस्तृत विश्लेषण के भीतरट्यूमर microenvironment तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है। यहाँ, हम एक माउस ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर microenvironment में उपस्थित घुसपैठ ल्युकोसैट कैंपेन्स का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन। माउस B16 मेलेनोमा ट्यूमर कोशिकाओं C57BL / 6 चूहों में subcutaneously inoculated थे। एक निर्दिष्ट समय में, ट्यूमर और आसपास त्वचा सामूहिक resected गया और फिर फ्लो बहु रंग के दाग थे जो एकल कक्ष निलंबन, में संसाधित। ल्युकोसैट सबसेट मार्करों की एक किस्म का उपयोग करना, हम नियंत्रण और chemerin व्यक्त ट्यूमर के बीच ल्युकोसैट कैंपेन्स घुसपैठ के रिश्तेदार प्रतिशत की तुलना में सक्षम थे। जांचकर्ता प्रतिरक्षा ट्यूमर microenvironment में उपस्थिति और ट्यूमर के विकास के पारंपरिक कैलीपर आकार माप के साथ संयुक्त, संभवतः उन्हें ट्यूमर के विकास पर प्रतिरक्षा संरचना में परिवर्तन के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए अनुमति देगा अध्ययन करने के लिए इस तरह के एक उपकरण का उपयोग कर सकते हैं। इस तरह की एक तकनीक किसी भी ट्यूमर मॉडल को लागू किया जा सकता है, जिसमें ट्यूमर और उसके microenvironment गएक resected और संसाधित किया।
Introduction
ट्यूमर के विकास को और बढ़ावा देने और प्रतिगमन के बीच संतुलन, भाग में, microenvironment 1,2 में मौजूद समर्थक और विरोधी ट्यूमर घुसपैठ leukocytes के संतुलन पर निर्भर है। (TME) ट्यूमर microenvironment का अध्ययन करने और विशेष रूप से घुसपैठ ल्युकोसैट उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए, हम एक murine ट्यूमर मॉडल में चमड़े के नीचे ट्यूमर के मूल्यांकन के लिए एक विधि विकसित की है। ट्यूमर microenvironment का अध्ययन करने के महत्व को अच्छी तरह से जाना जाता है और साहित्य में समर्थित है। कई अध्ययनों से समर्थक और विरोधी ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संतुलन माउस में बल्कि (3,4 में समीक्षा) मानव अध्ययन ही नहीं, ट्यूमर के विकास के परिणामों को प्रभावित कर सकता है कि पता चला है। उदाहरण के लिए, Curiel एट अल। डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों में नैदानिक परिणामों ट्यूमर घुसपैठ नियामक सीडी 4+ टी कोशिकाओं (Tregs) 5 के प्रतिशत में वृद्धि की उपस्थिति के साथ जोड़ा गया बिगड़ गई है कि पता चला है। हमारे अपने काम भी एक नहीं के प्रभाव को दिखायाभी साथ सहसंबद्ध जो एक माउस मेलेनोमा मॉडल 6, में ल्युकोसैट कैंपेन्स के अनुपात पर वेल ल्युकोसैट chemoattractant ट्यूमर के विकास को कम किया है। इस प्रकार, एक ट्यूमर के भीतर ल्युकोसैट कैंपेन्स के विस्तृत विश्लेषण अब अधिक मोटे तौर पर मान्यता प्राप्त है और तेजी से महत्वपूर्ण।
ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ के लिए ट्यूमर microenvironment का मूल्यांकन करने के लिए कई तरीके हैं; क्षमता के साथ कुछ – उदाहरण के लिए समूहों छवि TME 7, शास्त्रीय immunohistochemistry और ऐसे एमआरआई, पीईटी, confocal माइक्रोस्कोपी 9-11 के रूप में विभिन्न इमेजिंग तौर तरीकों सहित संरक्षित वर्गों 8, की इम्यूनोफ्लोरेसेंस के क्रम में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों इंजीनियर है intravitally 10,12 निगरानी। ये ऐसे नैनोकणों 13 या उपन्यास विपरीत एजेंटों प्रतिरक्षा कोशिकाओं लेबल कि 14 के रूप में विभिन्न आणविक इमेजिंग एजेंट, के साथ प्रयोग किया जा सकता है। हमारे विधि एक फ्लो आधारित दृष्टिकोण है और कई फायदे हैं।सबसे पहले, पूरे ट्यूमर microenvironment जांचा जा सकता है; विश्लेषण के समय में, पूरे चमड़े के नीचे ट्यूमर और आसपास के परिधि शल्य चिकित्सा के प्रसंस्करण के लिए resected है। यह एक ट्यूमर के भीतर किसी भी संभावित नमूने पूर्वाग्रह समाप्त और एक पूरे के रूप में ट्यूमर का एक और अधिक "वैश्विक" विश्लेषण देता है। दूसरे, ल्युकोसैट कैंपेन्स का विश्लेषण करने के लिए cytometry के बहुरंगा प्रवाह का उपयोग कर अधिक विशेष रूप से घुसपैठ leukocytes के फेनोटाइप गेज करने के लिए हमें की अनुमति देता है। प्रयुक्त रंग की संख्या पर निर्भर करता है, बहुत विशिष्ट सबसेट पहचाना जा सकता है। या यहां तक कि एक सामान्य उप वर्गीकरण में – – ट्यूमर के भाग्य का निर्धारण करने में संभावित महत्वपूर्ण हैं कि असमान कार्य किया है कि कई ल्युकोसैट एक विशेष सेल प्रकार के भीतर कैंपेन्स के रूप में वहाँ यह महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के 15 में फंसाया गया है। हालांकि, पीडीसी की CCR9 + सबसेट tolerogenic 16 होना दिखाया, और बीए स्थानांतरण कर दिया गया हैइस तरह के एक सबसेट के लांस ट्यूमर के विकास पर एक प्रभाव हो सकता है।
हमारे विधि चमड़े के नीचे या सामूहिक resected जा सकता है कि अन्य ट्यूमर के लिए उपयुक्त है। हमारे हाथ में, ट्यूमर समान रूप से इच्छामृत्यु के समय में resected थे। कुछ अध्ययनों में किया गया है के रूप में हालांकि, यह एक चमड़े के नीचे ट्यूमर पूरी तरह से इस प्रकार पशु के अतिरिक्त मूल्यांकन की अनुमति देता है, एक अस्तित्व सर्जरी 17 में चारों ओर की त्वचा के बंद होने के साथ resected किया जा सकता है, बोधगम्य है। विश्लेषण तो resected ट्यूमर पर किया जाता है। इस प्रकार, परिणाम ट्यूमर के विकास में एक भी timepoint प्रतिनिधित्व करते हैं। इस microenvironment में एक विस्तृत देखो की अनुमति देता है, यह भी कोई संदेह नहीं है एक गतिशील प्रक्रिया है की एक स्थिर तस्वीर है। हालांकि, पृथक ल्यूकोसाइट्स (जैसे के माध्यम से चुंबकीय जुदाई या घनत्व ढाल) previ किया गया है तो, ट्यूमर epithelia और स्ट्रोमा से अलग से विश्लेषण किया है, या आगे उनके फेनोटाइप को परिभाषित करने के लिए अन्य, कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया जा सकता हैously 18 में वर्णित है। इस विधि है, तो, प्राकृतिक रोग पाठ्यक्रम की स्थापना में, या एक विशिष्ट चिकित्सीय गड़बड़ी के बाद, चाहे एक निश्चित समय बिंदु पर ट्यूमर microenvironment भीतर leukocytes की संरचना को समझने में दिलचस्पी किसी भी जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा। हमारे द्वारा किया नहीं है, इस प्रक्रिया के रूपांतरों भी संभावित अलगाव में एक ट्यूमर के विशेष हिस्सों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर के आकार को देखते हुए परिधीय क्षेत्र (एस) के शोधकर्ता ट्यूमर microenvironment का एक और अधिक स्थानिक अलग दृश्य देने के लिए दूर ट्यूमर के मध्य, संभवतः परिगलित कोर से विच्छेदित किया जा सकता है।
ट्यूमर प्रतिरक्षा विज्ञान के तेजी से बढ़ते क्षेत्र में, इसमें कोई शक नहीं murine ट्यूमर मॉडल में उपन्यास immunomodulatory एजेंटों के मूल्यांकन के अध्ययन के एक तेजी से बढ़ रही संख्या में हो जाएगा। कई रिपोर्टों परिधीय एन बनाम ट्यूमर के भीतर विशिष्ट ल्युकोसैट समारोह में मतभेद उजागर किया हैvironment। उदाहरण के लिए, Shafer-वीवर एट अल। वे ट्यूमर microenvironment 19 में तस्करी एक बार प्रतिजन विशेष टी प्रेरक सीडी 8 + कोशिकाओं, परिधि में सक्रिय है, जबकि सीडी 8 + टी शमन कोशिकाओं में तब्दील किया गया है कि एक माउस मॉडल में दिखाया। इस TGFβ की वजह से भाग में था, लेकिन अन्य कारकों की संभावना के रूप में अच्छी तरह से शामिल रहे हैं। इस प्रकार, ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन – संख्या और अनुपात, साथ ही कार्यात्मक स्थिति – ट्यूमर के भीतर ही ट्यूमर भाग्य पर एक विशेष immunomodulation के प्रभाव का एक और अधिक सटीक प्रतिनिधित्व दे देंगे।
हमारी तकनीक ट्यूमर का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है और शोधकर्ता और अधिक बारीकी से पिछले दृष्टिकोण से ल्युकोसैट आबादी में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर microenvironment के विस्तृत विश्लेषण प्रदर्शन तंत्र और immunomodulation के प्रभाव का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है। ट्यूमर घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स पर इन एजेंटों के प्रभाव को समझने के लिए मानव नैदानिक दायरे में immu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम अनुदान R01-CA169354 द्वारा समर्थित किया गया और R01-047822 स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान और दिग्गजों मामलों के विभाग (ईसीबी) से एक मेरिट अवार्ड से। RKP एनआईएच T32 CA009287-30A1, एक ASCO युवा अन्वेषक पुरस्कार, कैलिफोर्निया स्तन कैंसर अनुसंधान परियोजना फैलोशिप, और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी Mentored रिसर्च स्कॉलर अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बाज एनआईएच अनुदान AI079320 द्वारा समर्थित किया गया। जेएम एनआईएच टी 32 प्रशिक्षण अनुदान T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 और अमेरिकन कैंसर सोसायटी के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप पीएफ-12-052-01-सीएसएम से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
