Evaluering av Tumor-infiltrere Leukocytt Delsett i en Subkutan Tumor Model
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Spesialiserte immunceller som infiltrerer svulsten mikromiljøet regulerer vekst og overlevelse av neoplasi. Ondartede celler må unnvike eller grave anti-tumor immunresponser for å overleve og blomstre. Svulster dra nytte av en rekke forskjellige mekanismer for immun "escape", inkludert rekruttering av tolerogene DC, immunosuppressive regulatoriske T-celler (Tregs) og myeloide-avledede suppressor celler (MDSC) som hemmer cytotoksiske antitumorrespons. Omvendt, kan anti-tumor effektor immunceller bremse veksten og ekspansjonen av maligniteter: immunstimulerende dendrittceller, naturlige dreperceller som rommer iboende antitumorimmunitet og cytotoksiske T-celler som alle kan delta i tumor suppresjon. Balansen mellom pro- og anti-svulst leukocytter i siste instans bestemmer atferd og skjebne av transformerte celler; en rekke kliniske studier har båret ut dette. Således detaljert analyse av leukocytt-undersett innenforsvulsten mikromiljøet har blitt stadig viktigere. Her beskriver vi en fremgangsmåte for analyse av leukocytt-infiltrering undergrupper som er tilstede i tumoren mikromiljøet i en musetumormodell. Mus B16 melanom-tumorceller ble inokulert subkutant i C57BL / 6 mus. På et angitt tidspunkt, ble det svulster og omliggende hud resected en bloc og bearbeidet til en enkelt cellesuspensjoner, som så ble farget for multi-farge flowcytometri. Ved hjelp av en rekke leukocytt delsett markører, var vi i stand til å sammenligne de relative prosenter av infiltrerende leukocyttpopulasjoner undergrupper mellom kontroll og chemerin-uttrykke svulster. Etterforskerne kan bruke et slikt verktøy for å studere immun tilstedeværelse i svulstens mikromiljø og kombinert med tradisjonelle caliper størrelse målinger av tumorvekst, potensielt vil tillate dem å belyse virkningen av endringer i immun sammensetning på tumorvekst. En slik teknikk kan anvendes på en hvilken som helst tumormodell hvor tumoren og dens mikro cen bli resected og behandlet.
Introduction
Balansen mellom tumorvekst og fremme regresjon og er, delvis, avhengig av balansen av pro- og anti-tumor-infiltrerende leukocytter som er tilstede i mikromiljøet 1,2. For å studere tumormikromiljøet (TME) og spesifikt identifisere de infiltrerende leukocytt-subpopulasjoner, har vi utviklet en metode for evaluering av subkutane tumorer i en murin tumormodell. Betydningen av å studere tumormikromiljøet er vel kjent og støttes i litteraturen. Tallrike studier har vist at balansen mellom pro- og anti-tumor infiltrerer immunceller kan påvirke utfallet av tumorvekst, ikke bare i mus, men også studier på mennesker (anmeldt i 3,4). For eksempel Curiel et al., Viste at forverret kliniske resultater i eggstokkkreftpasienter ble korrelert med nærvær av økende prosentandeler av tumor-infiltrerende regulatoriske CD4 + T-celler (Tregs) 5. Vårt eget arbeid viste også effekten av et neiVEL leukocytt kjemotiltrekkende på forholdet mellom leukocytt-undersett i en musemelanommodellen 6, som også korrelert med reduserte tumorvekst. Dermed er de detaljerte analyser av leukocytter undergrupper innenfor en svulst nå mer bredt anerkjent og blir stadig viktigere.
Det er mange måter å vurdere svulstens mikromiljø for infiltrering leukocytter; for eksempel grupper har utviklet transgene mus for å uttrykke ulike fluorescerende proteiner i orden til bilde TME 7, klassisk immunhistokjemi og immunfluorescens av bevarte §§ 8, inkludert ulike bildediagnostikk som MR, PET, konfokalmikroskopi 9-11 – noen med evnen til å overvåke intravitally 10,12. Disse kan brukes med forskjellige molekylbilleddannende midler, så som nanopartikler 13 eller nye kontrastmidler 14 som merke immunceller. Vår fremgangsmåte er flowcytometri-tilnærming, og har flere fordeler.Først kan hele svulsten mikromiljøet tas prøver; ved analyse, er hele subkutan tumor og rundt periferien kirurgisk reseksjon for behandling. Dette eliminerer ethvert potensielt prøvetaking forspenning innenfor et enkelt tumor og gir en mer "global" analyse av tumor som en helhet. Dernest bruker flerfarget flowcytometri for å analysere leukocytter undergrupper lar oss mer spesifikt måle fenotype av infiltrere leukocytter. Avhengig av antallet farger som brukes, kan svært spesifikke delsett bli identifisert. Dette er viktig da det er flere leukocytter undergrupper innenfor en bestemt celletype – eller til og med i en generell subtype klassifisering – som har ulike funksjoner som er potensielt betydelig i å bestemme skjebnen til svulsten. For eksempel har plasmacytoid dendrittceller (PDC) er implisert i anti-tumor-immunitet 15. Imidlertid har CCR9 + delmengde av PDCs blitt vist å være tolerogene 16, og forskyve balanse av en slik undergruppe kan ha en innvirkning på tumorvekst.
Vår fremgangsmåte er egnet for subkutan eller andre tumorer som kan resected en bloc. I våre hender, ble svulster jevnt resekterte ved tidspunktet for avlivning. Imidlertid er det tenkelig, slik det er gjort i noen studier, som en subkutan tumor kan være fullt resected med lukning av den omkringliggende huden i en overlevelses kirurgi 17, og dermed tillater ytterligere evaluering av dyret. Analysen ble deretter utført på den resected tumor. Dermed er resultatene representerer en enkelt endepunktet i tumorutviklingen. Selv om dette gjør en detaljert titt inn i mikromiljøet, er det også et statisk bilde av hva som er uten tvil en dynamisk prosess. Imidlertid isolerte leukocytter (for eksempel via magnetisk separasjon eller densitetsgradient) kan deretter bli analysert separat fra tumor epitel og stroma, eller brukes i andre, funksjonelle analyser for ytterligere å definere deres fenotype, som har vært Previgere beskrevet 18. Denne metoden, da ville være nyttig for noen forskere som er interessert i å forstå sammensetningen av leukocytter i tumormikromiljøet på et gitt tidspunkt, enten i innstillingen av det naturlige sykdomsforløpet, eller etter et bestemt terapeutisk perturbasjon. Selv om det ikke er gjort av oss, variasjoner av denne fremgangsmåten kan også potensielt anvendes til å analysere bestemte deler av en tumor i isolasjon. For eksempel, gitt størrelsen av tumoren, omkretssonen (e) kan bli dissekert vekk fra den sentrale, eventuelt nekrotisk kjerne av tumoren til å gi forskeren en mer romlig atskilt riss av tumormikromiljøet.
I den voksende feltet av tumorimmunologi, vil det uten tvil være en eksponentielt voksende antall studier som evaluerer nye immunmodulerende midler i murine tumormodeller. Flere rapporter har fremhevet forskjellene i spesifikk leukocyttfunksjonen innenfor tumor mot det perifere nomiljø. For eksempel, Shafer-Weaver et al., Viste i en musemodell som antigen-spesifikke T-effektorceller CD8 + celler, mens aktiv i periferien, ble transformert inn i CD8 + T-suppressor-celler når de trafikkert inn i svulsten 19 mikromiljøet. Dette var delvis på grunn av TGFp, men andre faktorer er sannsynligvis involvert også. Således evaluere leukocytt-undersett – tall og prosenter, samt funksjonelle status – blir i løpet av selve svulsten gi en mer nøyaktig representasjon av effekten av et bestemt immunmodulering på tumor skjebne.
Vår teknikk tillater detaljert analyse av tumoren, og gir forskeren en mulighet til nærmere å identifisere endringer i leukocytt-populasjoner enn tidligere tilnærminger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utføre detaljert analyse av svulsten mikromiljøet er avgjørende for å fastslå hvilke mekanismer og effekter av immunmodulering. Med den økende tilstedeværelsen av immunotherapeutics i den humane kliniske riket, forstå virkningen av disse midlene på tumor infiltrere leukocytter blir nødvendig å definere sin virkningsmekanisme. Hos mennesker er det ofte foreligge kliniske og / eller logistiske vanskeligheter med å fremskaffe og analysere tumorvev for leukocytt-undergruppe analyse, og dermed analyse av perifert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd R01-CA169354 og R01-047822 fra National Institutes of Health og en Merit Award fra Department of Veterans Affairs (ECB). RKP ble støttet av NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship, og en American Cancer Society mentor Forskningsstipendiat Grant; BAZ ble støttet av NIH stipend AI079320. JM ble støttet av stipend fra NIH T-32 trening stipend T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 og American Cancer Society post-doc PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
