This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Specialiserade immunceller som infiltrerar tumören mikromiljö reglera tillväxten och överlevnaden av neoplasi. Maligna celler måste undkomma eller undergräva antitumörimmunsvar för att överleva och blomstra. Tumörer dra fördel av ett antal olika mekanismer för immun "flykt", inklusive rekrytering av tolerogena DC, immunsuppressiva regulatoriska T-celler (tregs), och myeloida-härledda suppressorceller (MDSC) som hämmar cytotoxiska antitumörsvar. Omvänt kan antitumör effektorceller immunceller bromsa tillväxten och expansionen av maligniteter: immunstimulerande dendritiska celler, naturliga mördarceller som hyser medfödda antitumörimmunitet, och cytotoxiska T-celler kan alla delta i tumörsuppression. Balansen mellan pro- och antitumör leukocyter slutligen bestämmer beteende och öde transformerade celler; en mängd kliniska studier har burit ut det här. Således detaljerad analys av leukocyter delmängder inomtumören mikromiljö har blivit allt viktigare. Här beskriver vi en metod för att analysera infiltrerande leukocyter delmängder närvarande i tumörmikromiljön i en mus-tumörmodell. Mus B16 melanom-tumörceller inokulerades subkutant i C57BL / 6-möss. Vid en viss tidpunkt, var tumörer och omgivande hud resekterades klump och bearbetas till enkelcellsuspensioner, som sedan färgas för flera färger flödescytometri. Med hjälp av en mängd olika leukocyt delmängd markörer, kunde vi jämföra de relativa procentandelar av infiltrerande leukocyter delmängder mellan kontroll och chemerin uttryck tumörer. Utredarna får använda ett sådant verktyg för att studera immun närvaro i tumören mikromiljö och i kombination med traditionella bromsok storlek mätningar av tumörtillväxt, potentiellt ger dem möjlighet att belysa effekterna av förändringar i immun sammansättning på tumörtillväxt. En sådan teknik kan tillämpas på vilken tumör som helst modell där tumören och dess mikromiljö cen resekeras och bearbetas.
Balansen mellan tumörtillväxt och främjande och regression är delvis beroende av balansen mellan pro- och antitumör infiltrerande leukocyter som finns i mikromiljön 1,2. För att studera tumörmikro (TME) och specifikt identifiera infiltrerande leukocyter subpopulationer, utvecklade vi en metod för utvärdering av subkutana tumörer i en murin tumörmodell. Vikten av att studera tumörens mikromiljö är välkänd och stöds i litteraturen. Ett flertal studier har visat att balansen mellan pro- och antitumör infiltrerande immunceller kan påverka resultaten av tumörtillväxt, inte bara i mus utan också humanstudier (granskas i 3,4). Till exempel, Curiel et al. Visade att försämrats kliniska utfall i ovarian cancerpatienter var korrelerade med närvaron av ökande procentandelar av tumörinfiltrerande regulatoriska CD4 + T-celler (tregs) 5. Vårt eget arbete visade också effekten av ett nejvel leukocyt chemoattractant på förhållandet leukocyter delmängder i en mus melanom modell 6, som också korrelerad med minskad tumörtillväxt. Således är de detaljerade analyser av leukocyter delmängder inom en tumör nu mer allmänt erkänt och allt viktigare.
Det finns många sätt att utvärdera tumören mikromiljö för infiltrerande leukocyter; till exempel grupper har konstruerats transgena möss för att uttrycka olika fluorescerande proteiner för att bilden TME 7, klassisk immunohistokemi och immunofluorescens bevarade avsnitten 8, inklusive olika avbildningsmetoder såsom MRI, PET, konfokalmikroskopi 9-11 – några med förmågan att övervaka intravitally 10,12. Dessa kan användas med olika molekylavbildningsmedel, såsom nanopartiklar 13 eller nya kontrastmedel 14 som märka immunceller. Vår metod är en flödescytometri baserad metod och har flera fördelar.Först kan hela tumören mikromiljö provtas; vid tidpunkten för analysen, är hela subkutan tumör och omgivande periferin kirurgiskt opererande för bearbetning. Detta eliminerar varje eventuellt provtagning förspänning inom en enda tumör och ger en mer "globala" analys av tumören som helhet. För det andra, med hjälp av multi flödescytometri för att analysera leukocyt delmängder tillåter oss att mer specifikt bedöma fenotypen av infiltrerande leukocyter. Beroende på antalet färger som används, kan mycket specifika delmängder identifieras. Detta är viktigt eftersom det finns flera leukocyter delmängder inom en viss celltyp – eller till och med i en allmän subtyp klassificering – som har skilda funktioner som har en stor potential i att bestämma ödet för tumören. Exempelvis har plasmacytoid dendritiska celler (PDC) implicerats i antitumörimmunitet 15. Däremot har CCR9 + delmängd av pDCs visats vara tolerogena 16, och flytta över det balans av en sådan delmängd kan ha en inverkan på tumörtillväxt.
Vår metod är lämplig för subkutan eller andra tumörer som kan resekterade klump. I våra händer, var tumörerna likformigt resekterades vid tidpunkten för eutanasi. Det är dock tänkbart, så som har skett i vissa studier, att en subkutan tumör kunde helt opererande med nedläggningen av den omgivande huden i en överlevnads kirurgi 17, vilket möjliggör ytterligare utvärdering av djuret. Analysen utförs sedan på den resekterade tumören. Således, de resultat representerar en enda tidpunkt i tumörens utveckling. Även om detta gör att en detaljerad inblick i mikromiljön, är det också en statisk bild av vad som är utan tvekan en dynamisk process. Men isolerade leukocyter (t.ex. via magnetisk separation eller densitetsgradient) kan sedan analyseras separat från tumören epitel och stroma, eller användas i andra, funktionella analyser för att ytterligare definiera deras fenotyp, vilket har varit PREVígare beskrivits 18. Denna metod, då, skulle vara bra för alla utredare är intresserade av att förstå sammansättningen av leukocyter inom tumörmikro vid en given tidpunkt, vare sig i inställningen av den naturliga sjukdomsförloppet, eller efter en specifik terapeutisk störning. Även om det inte görs av oss, variationer av detta förfarande skulle även kunna utnyttjas för att analysera specifika delar av en tumör i isolering. Till exempel, med tanke på storleken av tumören, den perifera zonen (er) kunde dissekeras bort från den centrala, möjligen nekrotiska kärnan av tumören för att ge forskaren en mer rumsligt segregerad vy av tumörens mikromiljö.
I den spirande området tumörimmunologi, kommer det utan tvekan vara en exponentiellt växande antal studier som utvärderar nya immunmodulerande medel i murina tumörmodeller. Flera rapporter har belyst skillnaderna i specifik leukocytfunktion inom tumören kontra perifera svmiljön. Exempelvis Shafer-Weaver et al., Visade i en musmodell som antigenspecifik T effektor CD8 + -celler, medan aktiv i periferin, transformerades in i CD8 + T-suppressorceller när de trafikerade i tumörmikromiljön 19. Detta berodde delvis på grund av TGFp, men andra faktorer är sannolikt inblandade också. Således, utvärdera leukocyter delmängder – siffror och nyckeltal, samt funktionell status – kommer inom själva tumören ge en mer korrekt bild av effekten av en viss immunmodule på tumör öde.
Vår teknik tillåter detaljerad analys av tumören och förser forskaren tillfälle att närmare identifiera förändringar i leukocytpopulationer än tidigare metoder.
Utföra detaljerad analys av tumören mikromiljö är kritisk för att bestämma de mekanismer och effekter av immunmodule. Med den ökande förekomsten av immunotherapeutics i den humana kliniska sfären, förstå effekterna av dessa medel på tumörinfiltrerande leukocyter blir nödvändiga för att definiera deras verkningsmekanism. I människor, ofta existerar kliniska och / eller logistiska svårigheter att erhålla och analysera tumörvävnad för leukocyt delmängdsanalys, och sålunda analys av det perifera immu…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag R01-CA169354 och R01-047822 från National Institutes of Health och en Merit Award från Department of Veterans Affairs (ECB). RKP stöddes av NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, Kalifornien Breast Cancer Research Project Fellowship, och en American Cancer Society mentor Research Scholar Grant; BAZ stöddes av NIH bidrag AI079320. JM stöddes av stipendier från NIH T-32 utbildningsstipendium T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 och American Cancer Society Postdoktor PF-12-052-01-CSM.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |