Method Article

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

DOI:

10.3791/52665

⸱

May 1st, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute

In This Article

Summary

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인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.

Abstract

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다발성 골수종 (MM), 악성 형질 세포 질환, 난치성 유지 및 신규 약물은 환자의 예후를 개선하기 위해 요구된다. 인해 골 미세 자동 / 분비 성장 인자의 부족으로 인간 MM 세포는 배양하기 어렵다. 따라서, 인간의 MM 세포에 새로운 치료제의 작용을 연구하기 위해 시험 관내 및 생체 내 배양 시스템에서 적절한 확립이 절실히 요구되고있다. 여기서 우리는 시험 관내 및 생체 내에서 복잡한 3D 환경에서 인간 다발성 골수종 세포를 성장 모델을 제시한다. MM 세포주 OPM-2 및 RPMI-8226를 형질 전환 유전자 GFP를 발현하는 형질 감염시키고 인간 중간 엽 세포와 콜라겐의 존재 하에서 배양 하였다 타입 I 입체 타원체로 매트릭스합니다. 더하여, 구 상체는 닭 배아 융모 막 (CAM)에 그래프트 된 종양 성장은 스테레오 형광 현미경에 의해 모니터 하였다. 두 모델 모두 새로운 치료 DRU의 연구를 허용복잡한 3D 환경 및 트랜스 특정 GFP-ELISA에서의 균질화 이식 후 종양 세포 질량의 정량화에 GS. 또한, 직하 숙주 조직으로 호스트 및 종양 세포의 침윤 혈관 신생 반응을 입체 현미경으로 매일 모니터링 및 인간 종양 세포 (기-67, CD138, 멘틴) 또는 호스트 벽화 세포 덮는 혈관에 대해 면역 조직 화학 염색에 의해 분석 될 수있다 (최근 desmin / ASMA).

결론적 onplant 시스템은 복잡한 3 차원 환경에서 MM 세포 성장 및 혈관 신생을 연구 할 수 있으며 MM 세포의 생존과 증식을 치료 표적 신규 화합물에 대한 스크리닝을 가능하게한다.

Introduction

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다발성 골수종(MM)은 골수에서 악성 형질 세포의 증식, 뼈 병변 및 면역 결핍을 특징으로 합니다 1. 프로테아좀 억제제(보르테조밉)와 면역조절제(포말리도마이드, 레날리도마이드)와 같은 새로운 치료법이 있지만, MM은 여전히 암울한 예후를 가진 불치의 악성 종양으로 남아 있다 2. 나쁜 예후는 특히 MM 클론의 장시간 치료 및 선택 압력 하에서 치료에 대한 다양한 반응에 기여하는 MM 세포 클론의 특별한 이질성에 의해 설명될 수 있습니다 3.

체외 및 생체 내 신약 및 조합의 전임상 검사는 미래 약물 개발을 위한 중요하고 시간이 많이 소요되는 단계입니다. 따라서 질병의 생물학을 더 잘 이해하고 신약을 발견할 수 있도록 MM의 유용한 생체 내 모델이 필요합니다. 실제로, 혈액 악성 종양 및 치료제에 가장 적합한 이종 이식 모델은 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 마우스 4-7, 비만 당뇨병 / SCID (NOD / SCID) 마우스 8,9 또는 β-microglobulin-knockout NOD / SCID 마우스 10,11.

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Protocol

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실험 동물 복지의 hatching.The NIH 사무실이이 지역 (HTTP 작성 지침을 제공 할 때까지 오스트리아 법, 미국 공중 보건 서비스 조류 배아의 실험 동물 복지 사무소에 따르면 라이브 척추 동물로 간주되지 않습니다 // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 및 NIH 출판 번호 : 06-4515).

1. 세포 배양 및 렌티 바이러스 형질

  1. 문화 MM 세포주 OPM-2, RPMI-8226 및 RPMI1640 배지에서 골수로부터 인간 중간 엽 줄기 세포의 존재에서 10 % 소 태아 혈청, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민으로 보충 37 ℃에서 5 % CO 2.
  2. 형질 감염 5 × 30 μL 리포좀 형질 감염 시약과 형질 매체 (10 mL)을 이용하여 바이러스 포장 믹스 (9 μg의) 및 3 μg의 DNA pLenti6 / V5 DEST eGFP는 벡터 6 HEK 293FT 세포. 12 시간 후 형질 매체를 제거하고10 % 소 혈청 및 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)과 10 ml의 DMEM 배지를 추가한다.
  3. 오일 후, 수영 세포 (1,000 XG, 5 분)의 ....

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Results

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3D 다발성 골수종 타원체 내 분석 대상 화합물의 시험 관내 분석에서

때문에 체외에서 일차 인간 MM 세포 배양의 한계로는 골수에서 세포 성장 매트릭스 및지지 차 인간 중간 엽 세포 이용하게 인간 MM 세포 라인에 대한 새로운 3D 체외 배양 모델을 확립 (도 1a를, B). EGFP 유전자 MM 셀 라인은 회전 타원체의 3D 성장 후 시각화 및 MM 종양 질량의 정량화 할 수 있습니다. 두 MM 세포주 OPM -2- eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는 스테레오 형광 현미경에 GFP의 발현에 의해 가시화 하였다 볼테 조미 브 및 종양의 증가 농도 (1~100 ㎚)의 존재하에 3 일간 배양 하였다 (도 1C) . 종양 세포 덩어리 GFP-ELISA (도 1에 의해 .......

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Discussion

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내화성 MM에 대한 새로운 치료제의 개발은 약물에 대한 인간 MM 세포 민감도를 평가하는 데 시간이 덜 소요되고 비용이 생체 시스템을 필요로한다. 지금까지, 단 몇 생체 시스템은 새로운 항 골수종 치료의 임상 평가에 사용할 수 있습니다. 그들 모두는 화합물 라이브러리 (29)의 대규모 스크리닝에 대한 자신의 한계를 가지고있다.

인간의 MM 셀에 대한 가장 좋은 현재의 모델은 높은 면역 결핍 쥐 7,13,30, 터키의 배아 (29)이다. SCID 마우스 및 조류 배아 이종 이식 모델 모두 MM의 생물학을 연구 및 신규 치료 화합물을 시험하기 위해 사용될 수있다. 그러나 쥐의 시스템은 근친 유전자형, 기술적으로 까다로운 절차, 긴 관찰 기간과 높은 비용 등 여러 가지 한계를 가지고있다.

본 연구에서는, 신규 한 3D 타원체 조류 및 이종 이식 모델은 인간 MES의 존재를 포함 인간 MM 세포 생물학 연구를 .......

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 금융 이익이 없다

Acknowledgements

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저자는 면역조직화학과 닭 배아 준비에 대한 탁월한 기술적 도움을 준 Cornelia Heis에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 오스트리아 과학 기금(FWF 보조금 번호 P19552)과 유럽 연합(EU FP7 프로젝트 Optatio No: 278570)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI-8226 세포DSMZACC 9STR 프로파일
OPM-2 세포DSMZACC 50STR 프로파일 인간
중간엽 줄기 세포 PromoCellPC-C-12974
HEK293FT 셀 InvitrogenR700-07
RPMI1640 중간 크기의시그마 AldrichR0883
태아 소 세럼  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Strep 솔루션SigmaG6784
DMEM MediumGibco31966
NEAASigma Life SciencesM7145
Transfection Medium/Opti-MEM Gibco51985
eGFP 렌티바이러스 입자GeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105준비 완료 바이러스 입자
pLenti6/V5Dest6 eGFP 벡터InvitrogenPN 35-1271저자로부터의
ViralpowerTM 패키징 믹스 InvitrogenP/N 35-1275
트랜스펙션 시약/ Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
BlasticidinInvitrogenR210-01
NeomycinBiochromA2912
Collagen-Type1  쥐 꼬리BD Biosciences354236
DMEM 분말Life TechnologiesArt.Nr. 10338582
플리티뎁신Pharmamar
bortezomibLKT Lab., Inc.B5871
SPF-white hen eggsCharles RiverFertilized  white Leghorn  chicken eggs
Plastic weighing boatsneoLabArt.Nr. 1-1125ex-ovo culture
Petridish square (Lids)SimportD210-16ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x)Cell Signaling#9806
Protease 억제제 정제Roche11 836 170 001
완전한 미니 EDTA 프리
GFP ELISACell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
에탄올 앱솔루트Normapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
SuperFrost 현미경 슬라이드R. Langenbrinck 예술 .-Nr.
Labor- u. Medizintechnik03-0060
DakoCytomation 세척 버퍼 10xDakoCytomation코드-Nr.
S 3006
타겟 회수 용액 (10x)  pH 6,1DAKOCode-Nr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA 클론 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 클론 MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin 클론 V9DAKOM0725
m-a-hu Desmin 클론 D33DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  클론 MIB-1   다코  M7240
비오틴화 염소 - 안티 마우스 IgGVector Laboratories Inc.BA-9200
Vectastain Elite ABC 키트Vector Laboratories Inc.# PK-6100
FAST DAB 태블릿 세트.시그마 생화학 물질# D4293
Mayer ' s haemalaun 솔루션Merck1,092,490,500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
벤치 탑 로터리 마이크로톰Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
조직 임베딩 스테이션Leica, TP1020
달걀 부화기Grumbach BSS160
스테레오 형광 현미경은 디지털 카메라(Olympus E410)와 유연한 냉광과 연결되어 있습니다.올림푸스, SZX10
울트라 터락스 IKA T10균질화기
사용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
  2. Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
  3. Prideaux, S. M., Conwa....

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