Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Summary

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Abstract

Net als bij gezonde weefsels, veel bloed en solide tumoren zijn nu gedacht aan hiërarchisch georganiseerd worden, met een subset van stamcellen-achtige kankercellen die zichzelf te vernieuwen, terwijl die aanleiding geven tot meer gedifferentieerde nageslacht. Het begrijpen en zich richten op deze kankerstamcellen bij borstkanker, die verbeterde chemo- en radio-weerstand ten opzichte van de niet-stam tumor bulk kunnen bezitten, is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied. Markers zoals CD44, CD24 en ALDH activiteit kan beoordeeld worden met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om prospectief isoleren cellen die verbeterde tumorigeniciteit weergegeven wanneer geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen: de mammosphere test ook worden veel gebruikt voor zijn vermogen om achteraf identificeren sphere- vormende cellen die zich ontwikkelen uit enkele stamcel-achtige klonen. Hier schetsen we benaderingen voor de juiste kweken van mammospheres uit cellijnen of primaire monsters van patiënten, hun passage, en berekeningen te schatten bol forming efficiëntie (SFE). Eerst bespreken we de belangrijkste overwegingen en valkuilen in de juiste planning en interpretatie van mammosphere experimenten.

Introduction

Het bestaan ​​van de tumor cellijnen onder leiding van de stam-achtige kanker stamcellen is sterk toegevoegd aan ons begrip van de tumor heterogeniteit. Terwijl sommige fenotypische diversiteit in tumoren komt voort uit de klonale uitgroei van genetisch verschillende klonen, verschijnt er een substantieel onderdeel te vloeien uit epigenetische verschillen: kankercellen kan (soms reversibel) overgang tussen stam, stamvader, en gedifferentieerde staten via activering of onderdrukking van specifiek gen expressie programma's ^1-3. Dit kan cel intrinsieke of extrinsieke factoren weerspiegelen, die de genexpressie programma dat momenteel wordt uitgedrukt in e....

Protocol

De onderstaande procedures zijn ethisch goedgekeurd door het Imperial College in Londen.

1. Generatie van Primaire Mammospheres van Human Breast Cancer Cell Lines

OPMERKING: Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap.

1. Bereid Mammosphere media DMEM / F12 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine. Bereid compleet medium onmiddellijk vóór gebruik door toevoegen van 20 ng / ml recombinant humane epidermale groeifactor (EGF; Sigma), 10 ng / ml humaan recombinant basische fibroblast groeifactor (bFGF; R & D Systems) en 1 x B27 supplement.
2. Zuig ....

Results

Verschillende monsters of die aan verschillende behandelingen kunnen variëren in het aantal mammospheres> 40 urn die ontstaan ​​na normaliseren initiële cellen gezaaid. Bereken mammosphere vormende efficiëntie (MFE) voor elke behandeling gekweekt in drievoud. Dit maakt experimenten met verschillende dichtheden zaaien te vergelijken. Gegevens best weergegeven op een staafdiagram, idealiter met positieve en negatieve controles, en tonen de standaardafwijking over de drievoudige putjes. Consequent overdracht hechtende c.......

Discussion

Succesvolle evaluatie van de primaire en secundaire mammospheres vertrouwt op cellen worden uitgeplaat bij voldoende lage dichtheden die vorm mammospheres van enkele klonen, met minimale bol aggregatie. Maar op dichtheid te laag zijn, te weinig mammospheres kunnen vormen om de effecten van behandelingen statistisch onderscheiden. Zaaien dichtheid moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt omdat ze aanzienlijk in hun bol vormen efficiëntie kan variëren (die uitdrukken lage E-cadherine kan minder stabiel en ko.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146