פיתחנו מודל מבחנה של תרדמה במח העצם עבור תאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש במודל לחקר הביולוגיה המולקולרית והתאית של תרדמה וליצירת השערות לבדיקה עוקבת in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקר תרדמת סרטן השד במח העצם הוא משימה קשה במיוחד בשל מורכבות האינטראקציות של תאים רדומים עם המיקרו-סביבה שלהם, נדירותם והעודף העצום של תאים המטופויאטיים. לשם כך, פיתחנו מודל קלונוגני דו-ממדי במבחנה של תרדמה של תאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן במח העצם. המודל מורכב מכמה מרכיבי מפתח הנחוצים לתרדמה. אלה כוללים 1) שימוש בתאי סרטן שד רגישים לאסטרוגן, שהם הסוג שסביר שיישאר רדום לתקופות ממושכות, 2) דגירה של תאים בצפיפות קלונוגנית, כאשר האינטראקציה המבנית של כל תא היא בעיקר עם התשתית, 3) פיברונקטין, מרכיב מבני מרכזי של המח ו -4) FGF-2, גורם גדילה המסונתז בשפע על ידי תאי סטרומה של מח העצם ומופקד בכבדות במטריצה החוץ-תאית. תאים שהודגרו עם FGF-2 יוצרים שיבוטים רדומים לאחר 6 ימים, המורכבים מ-12 תאים או פחות בעלי מראה שטוח מובהק, גדולים משמעותית ומפוזרים יותר מאשר תאים גדלים ויש להם יחס ציטופלזמה לגרעין גדול. לעומת זאת, תאים שהודגרו ללא FGF-2 יוצרים בעיקר מושבות גדלות המורכבות מ->30 תאים קטנים יחסית. הפרעות של המערכת עם נוגדנים, מעכבים, פפטידים או חומצות גרעין ביום השלישי לאחר הדגירה יכולות להשפיע באופן משמעותי על היבטים פנוטיפיים ומולקולריים שונים של התאים הרדומים לאחר 6 ימים וניתן להשתמש בהן כדי להעריך את התפקידים של מולקולות מקומיות או תוך-תאיות, גורמים או מסלולי איתות על המצב הרדום או ההישרדות של תאים רדומים. תוך הכרה באופי המבחנה של הבדיקה, היא יכולה לתפקד ככלי שימושי ביותר לאיסוף מידע משמעותי על המנגנונים המולקולריים הדרושים להקמה והישרדות של תאים רדומים. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי ליצור השערות לבדיקה במודלים in vivo.
מבוא
תאי סרטן שד גרורות למוח העצם לפני שהמחלה היא 1 לזיהוי, ברגע שגידולים קטנים לפתח כלי דם 2,3. התהליך גרורתי הוא מהיר אבל לא יעיל. תאים להיכנס לכלי הדם החדשים במהירות, במיליון ליום 4 אבל כמה לשרוד את המסע לאיברים מרוחקים 5. עם זאת, כמה micrometastases לשרוד בעצמות ובניתן למצוא כתאים בודדים או גושי תא קטנים בaspirates מח עצם של חולים שאובחנו לאחרונה 1. תאים אלה להתנגד כימותרפיה אדג'ובנט, המנוהלת למטרה מאוד של חיסולם 6. התנגדות זו היא ניחן, באופן משמעותי, על ידי הישרדות איתות ביוזמת אינטראקציות עם מייקרו-סביבת מח עצם 7,8. ניתן למצוא Micrometastases בכשל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. Assay clonogenic
- הכן השעיות תא בודדות של שורות תאי סרטן השד תלוי באסטרוגן תאי MCF-7 וT47D באמצעות הצעדים המפורטים להלן
- לשאוב את מדיום התרבות (DMEM / 10% חום בסרום / גלוטמין מומת עגל עוברי ועט / סטרפטוקוקוס) מצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים שאינה מחוברים יותר מ- 50% עם MCF-7 או תאי T-47D. לשטוף עם PBS. דגירה עם טריפסין 0.25% / 2.21 mM EDTA מומס בגלוקוז הגבוהה DMEM על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-4 דקות.
- בדקו ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניסויים שנערכו כדי לשחזר את assay. במהלך הניסוי הזמן מוצג באיור 2 א. תאים טופחו על צפיפות clonogenic ביום -1, FGF-2 במדיום חדש מתווסף ביום 0 ותאים בתרבית עד שהיום 6 כאשר הם מוכתמים ומושבות נספרות. כל הפרעות למערכת מנוהלות ביום 3 ב100 כרכי μl ב10x ריכוזים סופיים רצוי. איור 2 מדגים את המראה האופייני של מושבות גדלו ורדומות. מושבות גדלו לכלול> 30 תאים ומושבות רדומות מכילות 12 או פחות תאים שהם פעמים רבות יותר גדולות מגידול תאים עם יחס ציטופלסמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המודל שלנו מורכב ממספר אלמנטים המרכזיים של תרדמת במח העצם. זה מורכב של אסטרוגן תאים רגישים, שהם הסוג צפוי להישאר רדום במוח לפרקי זמן ממושך 10, זה מורכב של פיברונקטין, אלמנט מבני עיקרי של מוח, FGF-2, גורם גדילה מסונתז בשפע על ידי סטרומה מח העצם והופקד בכבדות במטריקס של מח העצם 31,32 ודגירה של תאים בצפיפות clonogenic בי האינטראקציות שלהם הן בעיקר בתשתית. בעוד מייקרו-סביבת מח העצם הוא הרבה יותר מורכב, מערכת פשוטה זו יכולה להיות בנויה עם מורכבות ככל הוסיפו לפי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
נתמך על ידי משרד הגנה מענקי DAMD17-01-C-0343 וDAMD17-03-1-0524, נציבות מדינת ניו ג'רזי בחקר הסרטן 02-1140-CCR-E0 ורות Estrin גולדברג הזיכרון לחקר הסרטן (RW)
תודות
יש המחברים אין לחשוף.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאי MCF-7 | תאי ATCC | HTB-22 | |
| T47D | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom | TC-Treated TC Multiwell Plate Corning | 354411 | |
| BD BioCoat פיברונקטין 60 מ"מ צלחות תרבית | קורנינג | 354403 | |
| BD BioCoat פיברונקטין 100 מ"מ כלי תרבות | קורנינג | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22 מ"מ #1 כיסוי זכוכית עם מריחה אחידה של פיברונקטין | אנושיקורנינג | 354088 | |
| 6 באר צלחת תרבית רקמות | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco נשר שונה בינוני גבוה גלוקוז 10X אבקת | קורנינג מדעי החיים | 50-013-PB | |
| סרום בקר עוברי מושבת בחום | מקור | FB02-500HI | |
| 0.25% טריפסין/2.21 מ"מ EDTA | קורנינג | 25-053-CI | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X | קורנינג | 30-002-CI | |
| L-גלוטמין, 100x, | קורנינג | 25-005-CI | |
| FGF אנושי רקומביננטי מו | "פ בסיסי D Systems | 234-FSE-025 | |
| מעכב Akt (1L6-הידרוקסימתיל-כירו-אינוזיטול-2-(R)-2-O-מתיל-3-O-אוקטדציל-sn-גליצרוקרבונט) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | מעכב PI3K Chenical |
| C3 transferase | שלד הציטו | CTO3 | מעכב את RhoA, RhoB ו-RhoC, אך לא GTPases קשורים כגון Cdc42 או Rac1 |
| Y-27632 דיהידרוכלוריד | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (ירוק) | בדיקות מולקולריות | B607 | פלואורוכרום לצביעת אקטין פיברילרי |
| BODIPY FL-רודמין פלואידין (אדום) | בדיקות מולקולריות | R415 | פלואורוכרום לצביעת אקטין פיברילרי |
| Alexa Fluor 488 נוגדן IgG נגד עכבר חמור, מגיב ReadyProves | בדיקות מולקולריות | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPI | בדיקות מולקולריות | P-36931 |
מקורות
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
