Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.
Multippel sklerose er en inflammatorisk demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet kjennetegnet ved dannelse av plaque som inneholder tapte oligodendrocytter, myelin, aksoner og nerveceller. Remyelinering er en endogen reparasjonsmekanismen, hvorved ny myelin fremstilles etter at proliferasjon, rekruttering og differensiering av forløperceller oligodendrocytt i myelin dannende oligodendrocytter, og er nødvendig for å beskytte axoner mot ytterligere skade. For tiden er alle terapeutiske midler for behandling av multippel sklerose målrette avvikende immunkomponent av sykdommen, noe som reduserer inflammatoriske tilbakefall, men ikke forhindre progresjon til irreversibel nevrologisk nedgang. Det er derfor viktig at remyelinisering fremmende strategier utvikles som kan forsinke sykdomsutviklingen og kanskje reversere nevrologiske symptomer. Flere dyremodeller av demyelinisering eksisterer, inkludert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt og curprizone; Det er imidlertid et begrensetninger i deres bruk for å studere remyelinisering. En mer robust tilnærming er det sentrale injeksjon av giftstoffer i sentralnervesystemet, inkludert vaskemiddel lysolecitin i ryggmargen hvit substans fra gnagere. I denne protokollen, viser vi at den kirurgiske prosedyren involvert i å injisere lysolecitin inn i ventral hvit substans av mus er rask, kostnadseffektiv, og krever ingen ekstra materialer enn de som er kommersielt tilgjengelig. Denne fremgangsmåten er viktig ikke bare for å studere de normale hendelser involvert i remyelinering prosessen, men også som en pre-klinisk verktøy for screening av kandidat remyelinering fremmende terapeutika.
Multippel sklerose (MS) er en kronisk demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet (CNS), karakterisert ved å immuncelleinfiltrasjon og plaques som inneholder tapte myelin, oligodendrocytter, aksoner og nerveceller. De fleste pasienter har et sykdomsforløp som består av inflammatoriske tilbakefall ledsaget av et bredt spekter av nevrologiske symptomer, etterfulgt av perioder med remisjon. Over halvparten av disse pasientene etter hvert overgang til en sekundær progressiv scenen med ingen åpen tilbakefall, men kontinuerlig nevrologisk nedgang. Det antas at denne progressive svekkelse skyldes aksonal skade og tap, bidro delvis av kronisk demyelinisering. Strategier for å gjenopprette tapt myelin blir dermed ansett som en lovende behandling tilnærming for å forsinke sykdomsutviklingen og kanskje reversere nevrologiske symptomer.
Remyelinisering er en endogen reparasjon respons i CNS der nye myelin hylser genereres fra rekruttert oligodendrocyte forløperceller(OPCs) som differensieres til myelin dannende oligodendrocytter. Remyelinering har blitt vist i dyremodeller for å være ganske robuste 1-3, men avtar dens effektivitet med alderen 4. Faktisk skjer remyelinisering hos mennesker, selv om det er ufullstendig i flertallet av MS-pasienter fem. Alle for tiden tilgjengelige medikamenter for MS primært mot den avvikende immunkomponent av sykdommen, og samtidig effektive for å redusere tilbakefall, ikke markert forsinke progresjon av sykdommen. Den neste generasjonen av terapeutiske strategier for forvaltning av MS vil integrere fremskritt i immunmodulering med styrking av endogen remyelinisering for å forebygge både tilbakefall og progresjon seks.
En metode for å studere de- og remyelinering i CNS involverer direkte injeksjon av vaskemiddel lysofosfatidylcholin (lysolecitin) inn i ryggmargen hvit substans 1,3,7. Denne prosedyren gir en godt karakterisert demyelinating skade bestående hovedsakelig av makrofager / microglial infiltrasjon og aktivisering 8,9, reaktiv astrogliosis, forstyrrelse av aksonal homeostase / nerveskaden og OPC spredning og migrasjon 10. Lesjonen forutsigbart utvikler seg over en periode på et par uker, og er etter hvert i stand til å fullt ut remyelinating. Denne metoden har vært spesielt nyttig i å studere koreografien av hendelser involvert i de- og remyelinisering. Videre har det blitt vedtatt som et verktøy for pre-klinisk testing av kandidat terapi for å akselerere reparasjon etter en demyeliniserende fornærmelse.
Det er utviklet en rekke dyremodeller for å studere MS, mest recognizably den eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) modell. I EAE, er gnagere vaksineres mot et fragment av en myelin peptid og gjennomgå inflammatorisk lesjon utvikling manifestere i stigende lammelse. Selv om denne modellen har vært nyttig for pre-klinisk testing av immunmodulerende MS narkotika, er det ikke ideelt for å studere remyelinisering for tre hovedgrunner: For det første, er plasseringen av inflammatoriske lesjoner noe tilfeldig, og lokalisering av lesjoner ved behandling av vev for semi- eller ultratynne seksjoner kan være utfordrende. Det andre er at remyelinisering skjer over en bestemt tid selvfølgelig, og den nøyaktige alderen på en enkelt EAE lesjon kan ikke være kjent uten kontinuerlig non-invasiv magnetic resonance imaging. Det tredje er at remyelinering er et naturlig fenomen i gnagere, og tegn på remyelinering følgende behandling i EAE kan ikke være et primært resultat av stoffet, men istead et sekundært fenomen å redusere betennelse.
En annen vanlig fremgangsmåte for fremstilling av demyelinisering oppnås ved å innføre kobber chelator cuprizone i dietten. Dette resulterer i utbredt demyelinisering, særlig i corpus callosum. Det er begrensninger i å studere corpus callosum som et område av remyelinisering av følgende grunner: For det første, axon diameter (og dermed myelin tykkelse) er mindre enn andre CNS regioner, og dermed tynt remyelinated skjeder kan være umulig å skille fra de som var aldri demyelinerte. For det andre, fordi mus corpus callosum inneholder> 70% unmyelinated aksoner 16, kan det være uklart hvorvidt en remyelinated segment gjelder reparasjon av skadede myelin eller de novo-syntese myelin i den voksne, som forekommer normalt 17.
Det er vår oppfatning at den beste modellen for å studere remyelinisering er den direkte injeksjon av giftstoffer, enten lysolecitin, ethidIUM bromide, eller andre, i hale cerebrale peduncles 18 eller ryggmargen hvit substans. Den tidligere plassering oppnås bare ved nøyaktig tre-dimensjon stereotaktisk injeksjon, og er begrenset til større gnagere (rotter) på grunn av den lille størrelsen på lillehjernen peduncles. Dette utelukker omfattende ressurs av transgene mus i å studere de- og remyelinisering. Ryggmargen inneholder imidlertid mange store hvit substans traktater som er lett tilgjengelig kirurgisk. Mellomrommene mellom virvlene i rostrale thorax segment tillater eksponering av ryggmargen, uten behov for en laminektomi, som er et nødvendig trinn i caudal thorax kirurgiske prosedyrer. En fordel med spesifikt rettet mot ventral hvite saken er at aksonene er jevnt større enn rygg hvit substans, noe som gjør kvantifisering av remyelinisering en mindre tvetydig oppgave-lignende til utfordringene knyttet til corpus callosum. I tillegg utgjør en mye større t ventral hvit substansArget område å injisere; flere hundre mikron sideveis i den dorsale regionen ville plassere den kapillære utenfor kolonnen, mens det samme avviket ventralt vil likevel frembringe en fremtredende demyelinerende lesjon. Noen protokoller injisere lysolecitin i både dorsale og ventrale kolonner av det samme dyret 19. Dette kan øke både sannsynligheten for korrekt plassering og kapillær antall målbare lesjoner i færre dyr. Mens dagens data som presenteres er fra 8-10 uker gamle dyr på tidspunktet for drift, har vi også hatt suksess ved hjelp av samme prosedyre på 8-10 måneder gamle mus, der remyelinisering beskrives som å være markant tregere 4.
Kvantifisering av remyelinisering er ikke en triviell oppgave. En sentral dogmet postulerer at remyelinated segmenter er kortere i lengde og tynnere i gjennomsnitt enn sine motstykker sunne, og dermed beregninger g-ratio (axon diameter dividert med axon + myelin diameter) av tverrsnitts semi- or supertynn seksjonene blitt standard prosedyre. Det er imidlertid kjent at remyelinated segmenter tykne over tid to og en fersk studie ved hjelp av en transgen reporter fra remyelinating oligodendrocytter tyder på at mange internodes slutt bli umulig å skille fra kontroll 20. Kvantifisering av antall modne oligodendrocytter i lesjonen er en indirekte måte å måle reparasjon, oligodendrocytter som er i stand til å lage et stort antall internodes, og en vesentlig andel av remyelinering-avhengig av modellen benyttet-kan oppstå fra Schwann cellene 3. Selvfølgelig, som remyelinering har vært knyttet til gjenopprettelse av saltatory ledning 21, ville den endelige beregning av reparasjon være funksjonell bedring av nevrologiske underskudd. Mens remyelinisering har vært knyttet til utvinning av funksjon i enkelte arter 22,23, har det ikke blitt en standard prosedyre i murine lysolecitin studier. Dette er sannsynligvis på grunn av mangel på overt observatørbare underskudd fra enten rygg eller ventral lesjoner, sammenlignet med mer robuste demyelinisering modeller som EAE og selv cuprizone. Vi tror at funksjonelle underskudd som følge av lysolecitin injeksjon, og påfølgende gjenoppretting med remyelinisering, vil bare være observerbar bruker sensitive tester av fin sensorisk funksjon.
Et søk i PubMed med "remyelinisering" sammen med en av dyremodeller som er nevnt ovenfor, om enn en brysk metodisk tilnærming, viser færre søketreff for lysolecitin (109) sammenlignet med EAE (188) og cuprizone (197). Hvis vår argument at lysolecitin demyelinisering er den overlegne tilnærming for å studere remyelinisering, hvorfor er det det minste diskutert? Kanskje en pågripelse for å bruke denne metoden stammer fra en tro av tekniske problemer i å utføre kirurgisk operasjon. I virkeligheten er denne prosedyren rask, kostnadseffektiv, og er ikke vanskeligere enn rutine vev disseksjon, krever materialer som er kommersieltsielt tilgjengelig. Det er vårt håp at denne protokollen viser seg nyttig for de som ønsker å legge til denne kraftige modellen til sitt repertoar for å studere den spennende og voksende feltet av myelin reparasjon.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates – Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates – Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
clippers | Philips | QG3330 | |
heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
surgical tape | 3M | 1527-1 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
scalpel blade | Feather | No. 15 | |
sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
32 gauge metal needle | BD | 305106 | |
needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit |
priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
cryostat | Leica | CM1900 | |
microscope slides | VWR | 48311-703 | |
bright field microscope | Olympus | BX51 | |
ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
goat serum | Sigma | G9023 | |
Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2000 dilution |
Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
PBS | Oxoid | BR0014 | |
isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
ketamine | CDMV | ||
xylazine | CDMV | ||
iodine | West Penetone | 2021 | |
Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
sucrose | Sigma | S5016 | |
Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
horse serum | Sigma | H0146 | |
glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
corn oil | Sigma | C8267 | |
polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
glycerol | Sigma | G9012 | |
cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
Recipes | |||
Eriochrome cyanine solution | |||
Ingredient | Amount to add | ||
Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
sulfuric acid | 400 mL 0.5% | ||
iron(III)chloride | 20 mL 10% | ||
water | 80 mL | ||
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
Gelvatol | |||
Ingredient | Amount to add | ||
PBS | 140 mL | ||
polyvinyl alcohol | 20 g | ||
glycerol | 40 g | ||
*mix well, place at 37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes |