Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.
Multipel skleros är en inflammatorisk demyeliniserande sjukdom i det centrala nervsystemet som kännetecknas av plackbildning innehåller förlorade oligodendrocyter, myelin, axoner, och nervceller. Remyelinisering är en endogen reparation mekanism genom vilken nya myelin produceras efter spridning, rekrytering, och differentiering av oligodendrocyt prekursorceller i myelinbildande oligodendrocyter, och är nödvändig för att skydda axoner från ytterligare skador. För närvarande, alla läkemedel för behandling av multipel skleros rikta avvikande immun komponenten av sjukdomen, vilket minskar inflammatoriska skov men inte förhindra progression till irreversibel neurologisk nedgång. Det är därför viktigt att remyelinisering främjande strategier utarbetas som kan fördröja sjukdomsutvecklingen och kanske vända neurologiska symtom. Flera djurmodeller för demyelinisering finns, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit och curprizone; Det finns dock liminingar i deras användning för att studera remyelinisering. En mer robust metod är bränn injektion av gifter i det centrala nervsystemet, inklusive tvättmedels lysolecitin i ryggmärgen vita substansen av gnagare. I detta protokoll visar vi att det kirurgiska ingreppet involverad i att injicera lysolecitin i den ventrala vita substansen av möss är snabb, kostnadseffektiv och kräver inga ytterligare material än de som är kommersiellt tillgängliga. Detta förfarande är viktigt inte bara för att studera de normala händelser involverade i remyelinisering processen, men också som en preklinisk verktyg för screening kandidat remyelinisering främjande läkemedel.
Multipel skleros (MS) är en kronisk demyeliniserande sjukdom i det centrala nervsystemet (CNS) som kännetecknas av immuncellinfiltration och plack som innehåller förlorat myelin, oligodendrocyter, axoner och nervceller. De flesta patienter har en sjukdom kurs bestående av inflammatoriska skov tillsammans med ett brett spektrum av neurologiska symtom, följt av perioder av remission. Över hälften av dessa patienter så småningom övergå till en sekundär progressiv scen med några uppenbara återfall men kontinuerlig neurologisk nedgång. Man tror att denna progressiva försämringen beror på axonal skada och förlust, bidrog delvis av kronisk demyelinisering. Strategier för att återställa förlorad myelin anses därför en lovande behandlingsform för att fördröja sjukdomsförloppet och kanske vända neurologiska symtom.
Remyelinisering är en endogen reparationssvar i CNS vari nya myelinskidorna genereras från rekryteras oligodendrocyt prekursorceller(OPCs) som differentierar till myelinbildande oligodendrocyter. Remyelinisering har visats i djurmodeller för att vara ganska robust 1-3, dock avtar dess effektivitet med åldern 4. Faktum sker remyelinisering hos människor, även om den är ofullständig i majoriteten av MS-patienter 5. Alla närvarande tillgängliga läkemedel för MS rikta främst avvikande immun komponenten av sjukdomen och samtidigt effektiva för att minska återfall, inte markant fördröja sjukdomsutvecklingen. Nästa generation av terapeutiska strategier för hantering av MS kommer att integrera framsteg inom immunmodule med förstärkning av endogena remyelinisering för att förhindra både återfall och progression 6.
En metod för att studera de- och remyelinisering i CNS innefattar direkt injicering av tvättmedels lysofosfatidylkolin (lysolecitin) in i ryggmärgen vita substansen 1,3,7. Detta förfarande ger en väl karakteriserad demyelinating skada huvudsakligen av makrofag / microglial infiltration och aktivering 8,9, reaktiv astroglios, störning av axonal homeostas / axonal skada och OPC proliferation och migration 10 består. Lesionen utvecklas förutsägbart under period av några veckor och så småningom kapabel att fullt remyelinating. Denna metod har varit särskilt användbart för att studera koreografi av händelser som är involverade i de- och remyelinisering. Vidare har det antagits som ett verktyg för preklinisk testning av kandidatterapier att påskynda reparation efter en demyeliniserande förolämpning.
Ett antal djurmodeller har utvecklats för att studera MS, mest igenkännlig den experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) modell. I EAE är gnagare vaccineras mot ett fragment av en myelinpeptid och genomgår inflammatoriska lesion utveckling manifesterar i stigande förlamning. Även denna modell har varit till nytta för preklinisk testning av immunmoduler MS-läkemedel är det inte idealiskt för att studera remyelinisering främst av tre skäl: För det första, är något slumpmässig placering av inflammatoriska lesioner, och lokalisera lesioner vid bearbetning vävnad för semi- eller ultratunna sektioner kan vara utmanande. Det andra är att remyelinisering sker över en viss tidsförlopp, och den exakta åldern på en enda EAE lesion kan inte vara känd utan kontinuerlig icke-invasiv magnetisk resonanstomografi. Den tredje är att remyelinisering är en naturligt förekommande fenomen hos gnagare, och bevis på remyelinisering efter läkemedelsbehandling i EAE får inte vara en primär följd av drogen, men iStead ett sekundärt fenomen av att reducera inflammation.
En annan vanlig metod för framställning av demyelinering uppnås genom att införa koppar kelator cuprizone i kosten. Detta resulterar i omfattande demyelinisering, notably i corpus callosum. Det finns begränsningar i att studera corpus callosum som ett område av remyelinisering av följande skäl: För det första, axon diametrar (och därmed myelin tjocklek) är mindre än andra CNS regioner, och därmed tunt remyelinated slidor kan vara omöjlig att skilja från de som var aldrig demyelinerad. För det andra, eftersom musen corpus callosum innehåller> 70% omyeliniserade axoner 16, kan det vara oklart om en remyelinated segment är sant reparation av skadat myelin eller de novo myelin syntes i den vuxna, vilket sker normalt 17.
Det är vår övertygelse att den bästa modellen för att studera remyelinisering är direktinsprutning av toxiner, antingen lysolecitin, ethidiumbromid, eller andra, i stjärtfenan cerebrala skaft 18 eller ryggmärgen vita substansen. Den tidigare läge uppnås endast genom exakt 3-dimensionen stereotaktisk injektion, och är begränsad till större gnagare (råttor) på grund av den begränsade storleken på de cerebellära stjälkar. Detta utesluter omfattande resurs av transgena möss studera de- och remyelinisering. Ryggmärgen innehåller dock många stora vita substans som är lätt åtkomliga kirurgiskt. Utrymmen mellan kotor i den rostrala thoraxsegmentet möjliggör exponering av ryggmärgen utan behov av en laminektomi, vilket är ett nödvändigt steg i kaudala bröstkorg kirurgiska procedurer. En fördel med specifikt rikta den ventrala vita substansen är att axoner är jämnt större än ryggens vita substansen, vilket gör kvantifiering av remyelinisering en mindre tvetydig uppgifts liknar de utmaningar som är förknippade med corpus callosum. Dessutom gör den ventrala vita substansen upp en mycket större tArget område att injicera; flera hundra mikrometer i sidled i den dorsala regionen skulle placera kapillären utanför kolonnen, medan samma avvikelse ventralt fortfarande skulle producera en framträdande demyeliniserande lesion. Vissa protokoll injicera lysolecitin i både dorsala och ventrala kolumner av samma djur 19. Detta kan öka både sannolikheten för korrekt kapillär placering och antalet kvantifierbara lesioner i färre djur. Medan de nuvarande data som presenteras är 8-10 veckor gamla djur vid tidpunkten för operationen, har vi också haft framgång med samma procedur på 8-10 månader gamla möss, där remyelinisering beskrivs som markant långsammare 4.
Kvantifiering av remyelinisering är inte en trivial företag. En central dogma postulerar att remyelinated segmenten är kortare i längd och tunnare i genomsnitt än sina friska motsvarigheter, och således G-förhållande beräkningar (axon diameter dividerat med axon + myelin diameter) av tvärsnitts halv- or ultratunna avsnitt har blivit standardförfarande. Det är dock känt att remyelinated segment tjockna med tiden 2 och en ny studie med hjälp av en transgen reporter på remyelinating oligodendrocyter antyder att många inter blir så småningom att skilja från kontroll 20. Kvantifiera antalet mogna oligodendrocyter inom lesionen är ett indirekt sätt att mäta reparation, eftersom oligodendrocyter är kapabla att göra ett stort antal inter, och en betydande del av remyelinisering-beroende på vilken modell som används, kan uppstå från Schwannceller 3. Naturligtvis, som remyelinisering har kopplats till restaurering av saltatorisk ledning 21, skulle den ultimata metriska av reparation vara funktionell återhämtning av neurologiska bortfall. Medan remyelinisering har kopplats till återhämtning av funktionen i vissa arter 22,23, har det inte blivit ett standardförfarande i murina lysolecitin studier. Detta beror sannolikt på en brist på öppen observerbara underskott från antingen rygg eller ventrala skador, jämfört med mer robusta demyelinisering modeller såsom EAE och även cuprizone. Vi tror att funktionella underskott till följd av lysolecitin injektion, och efterföljande återhämtning med remyelinisering, endast kommer att kunna observeras med hjälp känsliga tester av fina sensomotoriska funktion.
En PubMed jakt efter "remyelinisering" tillsammans någon av djurmodeller som anges ovan, om än en brysk metodstrategi, visar färre sökträffar för lysolecitin (109) jämfört med EAE (188) och cuprizone (197). Om våra argument om att lysolecitin demyelinisering är överlägsen metod för att studera remyelinisering, varför är det den minst diskuteras? Kanske en uppfattning för att använda den här metoden kommer från en tro på teknisk svårighet i att utföra det kirurgiska ingreppet. I verkligheten är detta förfarande snabb, kostnadseffektiv, och är inte svårare än rutinvävnad dissektion, kräver material som är all kommersiellellt tillgängliga. Det är vår förhoppning att detta protokoll visar användbar för dem som vill lägga till denna kraftfulla modellen till sin repertoar för att studera den spännande och växande området myelin reparation.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates – Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates – Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
clippers | Philips | QG3330 | |
heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
surgical tape | 3M | 1527-1 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
scalpel blade | Feather | No. 15 | |
sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
32 gauge metal needle | BD | 305106 | |
needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit |
priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
cryostat | Leica | CM1900 | |
microscope slides | VWR | 48311-703 | |
bright field microscope | Olympus | BX51 | |
ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
goat serum | Sigma | G9023 | |
Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2000 dilution |
Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
PBS | Oxoid | BR0014 | |
isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
ketamine | CDMV | ||
xylazine | CDMV | ||
iodine | West Penetone | 2021 | |
Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
sucrose | Sigma | S5016 | |
Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
horse serum | Sigma | H0146 | |
glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
corn oil | Sigma | C8267 | |
polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
glycerol | Sigma | G9012 | |
cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
Recipes | |||
Eriochrome cyanine solution | |||
Ingredient | Amount to add | ||
Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
sulfuric acid | 400 mL 0.5% | ||
iron(III)chloride | 20 mL 10% | ||
water | 80 mL | ||
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
Gelvatol | |||
Ingredient | Amount to add | ||
PBS | 140 mL | ||
polyvinyl alcohol | 20 g | ||
glycerol | 40 g | ||
*mix well, place at 37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes |