Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation
Summary
Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d'isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l'adhésion avec les cellules cancéreuses.
Abstract
Neutrophiles extracellulaires Pièges (EVF) ont été récemment identifiés comme faisant partie de l'arsenal antimicrobienne de neutrophiles. Outre leur rôle dans la lutte contre les infections, des recherches récentes ont démontré qu'ils peuvent être impliqués dans de nombreux autres processus de la maladie, y compris la progression du cancer. Isoler NET purifiés est un élément crucial pour permettre l'étude de ces fonctions.
Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode simplifiée de l'isolement de NET exempt de cellules du sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. NET isolés peuvent ensuite être utilisés pour immunofluorescence, buvard ou de divers tests fonctionnels. Cela permet une évaluation de leurs propriétés biologiques, en l'absence des effets de confusion potentiels de neutrophiles eux-mêmes.
Une technique de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler des neutrophiles à partir de sang entier de donneurs en bonne santé. Les neutrophiles isolés sont ensuite stimulées par du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour induire NETosis. Les neutrophiles activés sont ensuite rejetées, et un stock net sans cellules sont obtenues.
Nous montrons ensuite comment TNE isolé peut être utilisé dans un essai d'adhérence avec des cellules de cancer du poumon humain A549. Le stock net est utilisé pour recouvrir les puits d'une 96 puits culture cellulaire plaque O N, et après s'être assuré une formation de monocouche NET adéquate sur le fond des puits, CFSE étiquetés cellules / A549 sont ajoutés. Les cellules adhérentes sont quantifiés à l'aide d'un microscope à fluorescence Nikon TE300. Dans certains puits, 1000U DNAse1 est ajouté 10 min avant de compter à dégrader NET
Introduction
Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont nouvellement découvert des éléments de neutrophiles dérivés composées de brins d'ADN extracellulaire décorées par des centaines de protéines et les histones. Elles sont sécrétées par les neutrophiles dans le contexte de l'infection et l'inflammation suivants stimuli spécifiques et ils ont été comptabilisés initialement faire partie des mécanismes de défense de l'neutrophiles contre les infections. Ils ont d'abord été présentés à promouvoir le piégeage de divers envahisseurs microbiens tels que les bactéries, virus et champignons 1-3. Le piégeage du microbe serait alors conduire à sa destruction à la fois directement par les protéines de NET-associé 3,4 et indirectement par le recrutement local des cellules phagocytaires 5,6. Le rôle des filets ne semble toutefois pas être limité à défense de l'hôte. Plus récemment, ils ont été montré à jouer un rôle important dans les maladies auto-immunes 7,8, 9 thrombose, des troubles liés à la grossesse 10 et même la progression du cancer11,12. En conséquence, il apparaît que les filets jouent un rôle important dans un grand nombre de divers processus physiologiques. Toutefois, étant donné le roman nature de ces recherches, il reste beaucoup à élucider ce qui concerne les mécanismes par lesquels NET exercent leurs effets. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour l'isolement de NET en l'absence de neutrophiles.
Dans la vidéo suivante, nous démontrons une technique simplifiée et facile à isoler NET au sang total humain. NET sans cellules peuvent ensuite être utilisés dans un certain nombre d'expériences in vitro, y compris coloration, imuunofluorescence, effaçant ainsi que d'un certain nombre d'analyses telles que l'adhérence, la prolifération et la migration. D'autres protocoles existent 13, 19, mais ils sont généralement long, complexe, coûteux, et souvent, faible rendement 13. Ce protocole simplifié utilise des réactifs de base et diminue le nombre d'étapes nécessaires pour isoler les neutrophiles, ce qui réduit donc la longueur du procre tout en maximisant le rendement.
Procédé suivant combine différentes techniques pour l'isolement des neutrophiles décrits précédemment dans la littérature pour obtenir un protocole simple qui donne un échantillon très pur de neutrophiles vivants. Comme suggéré dans la littérature, le sang veineux est recueilli dans des tubes EDTA et utilisé dans les 10 minutes pour éviter l'activation des neutrophiles 14. Nous utilisons des médias de séparation de lymphocytes (LSM) centrifugation en gradient de densité pour isoler les granulocytes et les globules rouges à partir de sang entier héparinisé, une méthode adaptée de la technique de centrifugation par densité de Ficoll initialement décrite par Boyum 15 et al. LSM est une modification de la formulation Boyum qui substitue le diatrizoate de sodium pour le métrizoate de sodium et a été utilisé avec succès dans de nombreuses études pour isoler les neutrophiles 16-18.
Après centrifugation différentielle de densité, les monocytes et les lymphocytes sont rejetés; les globules rouges sont ensuite sédimentéesen utilisant une solution de dextrane à 6% et 14 les globules rouges restants sont lysées pour obtenir une population de neutrophiles purs, ce qui est vérifié au bleu Trypan et une coloration au bleu de méthylène.
De nombreux agents ont été utilisés pour induire NETosis la fois in vitro et in vivo, y compris un lipopolysaccharide (LPS) et de l'acétate myristate de phorbol (PMA) et les interleukines (IL-8) 3,5,6. Dans le protocole suivant, les neutrophiles isolés sont stimulés avec 500 nM de PMA pendant 4 h, ce qui a été montré être une concentration suffisante pour permettre la formation NET cohérente et fiable sans favoriser l'apoptose 19,20.
Après isolement, nous montrons comment NET sans cellules obtenues à partir de ce protocole peuvent être utilisés dans un test d'adhérence. DNAse1 est utilisé pour digérer et dégrader NET comme décrit précédemment et sert de témoin 2,3,11 ainsi. D'autres options incluent l'utilisation d'un inhibiteur de l'élastase neutrophile (IEN) pour inhiber formati NETsur, qui est une alternative acceptable lorsque l'objectif est d'inhiber la formation NET plutôt que de réaliser leur dégradation 11. Bien NEi a un certain nombre de fonctions variées, il a été précédemment montré que le dépôt NET peut être inhibée par NEi par blocage de la décondensation de la chromatine, la dégranulation des neutrophiles nucléaire et la mort 12
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole d'isolement de neutrophiles Piège extracellulaire démontré dans cette vidéo combine différentes techniques utilisées dans la littérature pour l'isolement des neutrophiles et formation NET. Il simplifie un processus assez complexe et variable et offre un moyen très fiable et reproductible pour isoler NET sans cellules purifiées avec moins d'étapes que les autres protocoles. En outre, des réactifs facilement disponibles sont employés ajoutent à la simplicité des protocoles et de réd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
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