Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación
Summary
En el siguiente protocolo, se describe una manera muy simple para aislar las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) a partir de sangre humana entera utilizando reactivos fácilmente disponibles. A continuación, demostramos cómo las redes aisladas se pueden utilizar en un ensayo de adhesión in vitro con células cancerosas.
Abstract
Neutrófilos extracelular Trampas (TNE) se han identificado recientemente como parte del arsenal antimicrobiano de los neutrófilos. Aparte de su papel en la lucha contra las infecciones, la investigación reciente ha demostrado que pueden estar implicados en muchos otros procesos de enfermedad, incluyendo la progresión del cáncer. El aislamiento de los TNE purificadas es un elemento crucial para permitir el estudio de estas funciones.
En este vídeo, se demuestra un método simplificado de celda de aislamiento NET libre de sangre humana utilizando reactivos fácilmente disponibles. TNE aisladas se pueden utilizar para la tinción de inmunofluorescencia, secante o varios ensayos funcionales. Esto permite una evaluación de sus propiedades biológicas en ausencia de los posibles efectos de confusión de los propios neutrófilos.
Una técnica de separación por gradiente de densidad se emplea para aislar los neutrófilos de donante sano de sangre entera. Neutrófilos aislados se estimularon por forbol 12-myriState 13-acetato (PMA) para inducir NETosis. Los neutrófilos activados se descartan, y se obtiene una acción NET libre de células.
A continuación, demostramos cómo TNE aislado se puede utilizar en un ensayo de adhesión con células de cáncer de pulmón humano A549. El stock de NET se utiliza para recubrir los pocillos de una de 96 pocillos de cultivo celular placa de O / células A549 N, y después de asegurar la formación de una monocapa NET adecuada sobre el fondo de los pocillos, CFSE marcadas se añadidas. Las células adherentes se cuantificaron utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon TE300. En algunos pozos, 1000U Dnase1 se añade 10 min antes de contar para degradar los TNE
Introduction
Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) han sido recientemente descubiertos elementos derivadas de neutrófilos compuestas de cadenas de ADN extracelular decorados por cientos de proteínas y las histonas. Ellos son secretadas por los neutrófilos en el contexto de la infección y la inflamación siguientes estímulos específicos y se registran inicialmente a formar parte de los mecanismos de defensa de los neutrófilos frente a las infecciones. Se les mostró primero en promover la captura de varios invasores microbianos incluyendo bacterias, virus y hongos 1-3. Atrapar del microbio entonces conducir a su destrucción, tanto directamente por las proteínas NET asociada 3,4 e indirectamente a través de la contratación local de las células fagocíticas 5,6. El papel de las redes sin embargo no parece limitarse a la defensa del huésped. Más recientemente, se ha demostrado jugar un papel importante en las enfermedades autoinmunes 7,8, trombosis 9, trastornos relacionados con el embarazo 10 y hasta la progresión del cáncer11,12. En consecuencia, parece que las redes juegan un papel importante en un gran número de diversos procesos fisiológicos. Sin embargo, dado el carácter novedoso de esta investigación, aún queda mucho por aclarar con respecto a los mecanismos por los cuales los TNE ejercen sus efectos. Aquí, presentamos un método simplificado para el aislamiento de los TNE en ausencia de neutrófilos.
En el siguiente vídeo, se demuestra una técnica simplificada y fácil de aislar los TNE de sangre humana. TNE libres de células se pueden utilizar en una serie de experimentos in vitro que incluyen la tinción, imuunofluorescence, borrando así como un número de ensayos tales como la adhesión, la proliferación y la migración. Existen 13, 19 Otros protocolos, sin embargo, son generalmente largo, complejo, costoso, y, a menudo, bajo rendimiento 13. Este protocolo simplificado utiliza reactivos básicos y disminuye el número de pasos necesarios para aislar los neutrófilos, por lo tanto, minimizar la longitud de la procedire al tiempo que maximiza el rendimiento.
El siguiente método combina diferentes técnicas para el aislamiento de neutrófilos se han descrito previamente en la literatura para obtener un protocolo simple dando una muestra muy pura de neutrófilos vivos. Como se sugiere en la literatura, la sangre venosa se recoge en tubos con EDTA y usado dentro de 10 minutos para evitar la activación de neutrófilos 14. Utilizamos medios de separación de linfocitos (LSM) centrifugación en gradiente de densidad para aislar los granulocitos y las células rojas de la sangre a partir de sangre entera heparinizada, un método adaptado de la técnica de centrifugación de densidad Ficoll descrito inicialmente por Boyum et al 15. LSM es una modificación de la formulación Boyum que sustituye diatrizoato de sodio para la metrizoato de sodio y se ha utilizado con éxito en muchos estudios para aislar los neutrófilos 16-18.
Después de la centrifugación de densidad diferencial, monocitos y linfocitos se descartan; los glóbulos rojos se sedimentaronutilizando una solución de dextrano 6% 14 y los glóbulos rojos restantes se lisan para obtener una población de neutrófilos puros, que se verifica con azul Trypan y tinción con azul de metileno.
Numerosos agentes se han utilizado para inducir NETosis tanto in vitro como in vivo, incluyendo lipopolisacárido (LPS), y acetato de forbol miristato (PMA) y las interleucinas (IL-8) 3,5,6. En el siguiente protocolo, los neutrófilos aislados se estimularon con 500 nM PMA durante 4 h, que se ha demostrado que es una concentración adecuada para permitir la formación NET consistente y fiable sin promover apoptosis 19,20.
Después del aislamiento, nos demuestran cómo los TNE libres de células obtenidas a partir de este protocolo se puede utilizar en un ensayo de adhesión. Dnase1 se utiliza para digerir y degradar TNE como se describió anteriormente y por lo tanto sirve como un control 2,3,11. Otras opciones incluyen el uso de inhibidor de la elastasa de los neutrófilos (NE) para inhibir NET formati, lo cual es una alternativa aceptable cuando el objetivo es inhibir la formación NET en lugar de efectuar su degradación 11. Aunque NE _ tiene un número de funciones variadas, se ha demostrado previamente que NET deposición puede ser inhibida por NEi a través del bloqueo de descondensación de la cromatina, la desgranulación nuclear y la muerte de neutrófilos 12
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de aislamiento de Trampa neutrófilos extracelular se demuestra en este vídeo combina diferentes técnicas utilizadas en la literatura para el aislamiento de neutrófilos y la formación de NET. Simplifica un proceso bastante complejo y variable y ofrece una forma muy fiable y reproducible para aislar los TNE libres de células purificadas con menos pasos que otros protocolos. Por otra parte, los reactivos fácilmente disponibles se emplean agregando a la simplicidad protocolos y reducir significativamente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
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