एक enzymatic विधि पका अस्थि मज्जा के नमूनों से mesenchymal स्टेम सेल बचाव करने के लिए
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Mesenchymal स्टेम सेल (MSCS) पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। वे उन्हें ऑटोलॉगस उपचारों 2,3 के लिए आदर्श उम्मीदवार renders, जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं एक में अंतर और टीका लगाना, विस्थापित कर सकते हैं। हाल ही में, हड्डी और उपास्थि की मरम्मत के लिए MSCs का उपयोग कर क्लिनिकल परीक्षण, मेजबान रोग या दिल की बीमारी बनाम भ्रष्टाचार 4 का शुभारंभ किया गया। ये MSCs गर्भनाल या वसा ऊतकों से काटा जा सकता है, लेकिन सबसे आशाजनक परिणाम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं 5 से प्राप्त किया गया।
श्रोणिफलक शिखा अस्थि मज्जा की काफी मात्रा में एकत्र करने के लिए अनुमति देता है और इसलिए आकांक्षा 6 की मुख्य साइट के रूप में कार्य करता है। हालांकि, महाप्राण की गुणवत्ता में वापस ले लिया अस्थि मज्जा की मात्रा बढ़ाने के साथ घट जाती है। अस्थि मज्जा महाप्राण के पहले 5 मिलीलीटर उच्च गुणवत्ता के MSCs होते हैं, वहीं बड़ी मात्रा की वापसी परिधीय रक्त च के साथ महाप्राण के कमजोर पड़ने की ओर जाता हैअत्यधिक vascularized हड्डी 7 रोम। Anticoagulants उपयोग किया जाता है क्योंकि जब तक वर्तमान megakaryocytes और प्लेटलेट्स की, अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस, थक्के होने का खतरा है। लेकिन फिर भी anticoagulants के साथ, थक्के हो सकती है।
अस्थि मज्जा में, MSCs कुल सेल पूल 8 का केवल एक छोटे से अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं और सबसे ऊतक इंजीनियरिंग या चिकित्सीय अनुप्रयोगों 4 के लिए संस्कृति में विस्तार किया जाना है। इस तरह के एक संस्कृति की गुणवत्ता में काफी हद तक प्रारंभिक सेल पूल, यानी पर निर्भर करता है।, विविधता और एक उच्च प्रारंभिक संख्या 9। निकासी से MSCs की कम संख्या आंशिक रूप से दाता परिवर्तनशीलता से समझाया जा सकता है। दूसरी ओर, कम गुणवत्ता नमूनों से MSCs कोशिकाओं की वांछित संख्या तक पहुंचने के लिए संस्कृति में लंबे समय के लिए और बढ़ा दिया passaging की आवश्यकता होती है। या तो मामले में, विस्तारित passaging सेल वार्धक्य का एक स्रोत है और 10 संभावित भेदभाव की हानि हो सकती है। इसलिए, सेल Y अधिकतम कर सकते हैं कि प्रोटोकॉल अनुकूलितield और हानिकारक प्रभावों 11,12 विकसित किया जाना है से रोका जा सके।
हम कुत्ते MSCs के साथ काम करना शुरू किया जब सौभाग्य से पका मानव नमूने (दस में से एक) लगातार कम थे, हम, के बारे में तीन से चार में कुत्ते अस्थि मज्जा के नमूनों के थक्के निहित है कि देखने के लिए चकित थे। दूसरी ओर यह हम पका नमूनों से MSCs की बहुत कम पैदावार मनाया कि, कोई आश्चर्य की बात थी। पका हुआ नमूनों की आवर्ती मुद्दे को हल करने के लिए, हम resampling की बजाय थ्रांबोलिटिक दवा Urokinase का उपयोग कर प्रोटोकॉल विकसित की है।
थ्रांबोलिटिक उपचारों जैसे दिल का दौरा, स्ट्रोक या क्योंकि अवांछित थक्के की embolisms के कारण रक्त वाहिकाओं की आड़ के रूप में जीवन स्थितियों की धमकी प्रतिक्रिया कर सकते हैं। वे plasmin और enzymatic plasminogen activators द्वारा आतंच के enzymatic दरार के माध्यम से थक्के की गिरावट से काम करते हैं। रोगियों के उपचार के लिए व्यापक उपयोग के बावजूद, केवल बहुत कुछ प्रकाशनों उपयोग किया थ्रांबोलिटिक गतिविधियों कि मौजूदप्रयोगशाला अनुप्रयोगों पका नमूने बचाव करने के लिए, ज्यादातर लिम्फोसाइटों पर केंद्रित थी। 1987 में, निकू एट अल। 13 और चार साल बाद कार्यात्मक लिम्फोसाइटों में जिसके परिणामस्वरूप रक्त के थक्के को भंग करने के लिए streptokinase के उपयोग का वर्णन किया, डी विज़ एट अल। प्रवाह cytometric आवेदनों 14 के लिए रक्त और अस्थि मज्जा से ल्यूकेमिया कोशिकाओं को अलग करने के लिए streptokinase का उपयोग बढ़ाया। एक और अधिक हाल ही में प्रकाशन कैंसर निदान 15 के लिए Alteplase के उपयोग का सुझाव देते हैं। एक ही एंजाइमी दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं, हमारे प्रोटोकॉल स्टेम सेल के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक उपकरण प्रदान करने के लिए multipotent MSCs फार्म अस्थि मज्जा के अलगाव पर केंद्रित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगी केवल थोड़ा अतिरिक्त काम आपरेशन थिएटर में कर्मियों द्वारा किया जा करने के लिए है कि लाभ के साथ, (हमारे मामले में मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी की सर्जरी में) सर्जरी के दौर से गुजर रहा है, जबकि नियमित रूप ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
