Summary

HPLC Måling af DNA Oxidation Biomarkør, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin i dyrkede celler og animalsk væv

Published: August 01, 2015
doi:

Summary

Målet med denne protokol er påvisningen af ​​DNA oxidation markering, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo) ved HPLC-DE, i DNA fra dyrkede celler eller dyrevæv.

Abstract

Oxidativt stress er forbundet med mange fysiologiske og patologiske processer, samt xenobiotisk metabolisme, hvilket fører til oxidation af biomakromolekyler, herunder DNA. Derfor er det vigtigt for en række forsknings- discipliner, herunder medicin og toksikologi effektiv detektion af DNA oxidation. En fælles biomarkør for oxidativt beskadiget DNA er 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo, ofte fejlagtigt betegnet som 8-hydroxy-2'-deoxyguanosin (8-OH-dGuo eller 8 -oxo-dG)). Adskillige protokoller til 8-oxo-dGuo måling ved højtryksvæskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ED) er blevet beskrevet. Imidlertid blev disse hovedsagelig anvendes til oprenset DNA behandlet med pro-oxidanter. Hertil kommer, på grund af metodologiske forskelle mellem laboratorier, primært på grund af forskelle i analyseudstyr, vedtagelse af publicerede metoder til påvisning af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED kræver omhyggelig optimering af hvert laboratorium. Enomfattende protokol, som beskriver en sådan optimeringsproces, mangler. Her er en detaljeret protokol beskrevet for påvisning af 8-oxo-dGuo ved HPLC-DE, i DNA fra dyrkede celler eller dyrevæv. Det illustrerer, hvordan forberedelse DNA-prøve kan let og hurtigt optimeret til at minimere uønsket DNA oxidation, der kan forekomme under forberedelsen. Denne protokol viser, hvordan man kan opdage 8-oxo-dGuo i dyrkede humane alveolære adenocarcinomceller (dvs. A549-celler) behandlet med oxidationsmidlet KBrO 3, og fra milten af mus udsat for den polycykliske dibenzo aromatisk carbonhydrid (def, s) chrysen (DBC, tidligere kendt som dibenzo (a, l) pyren, DalP). Samlet set dette arbejde illustrerer, hvordan en HPLC-ED metode kan let optimeres til påvisning af 8-oxo-dGuo i biologiske prøver.

Introduction

Reaktive ilt arter (ROS), hvis steady state niveauer kan stige under mange patologiske tilstande og xenotoxic stofskifte, bidrager til en øget frekvens af oxidative DNA-skader. Blandt flere mulige nukleobaser oxidationsprodukter kan let måles, oxidativ DNA-beskadigelse bruge den stabile markør 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo), som er en af ​​de oxiderede former af 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo er den mest udbredte DNA læsion 2, og derfor er blevet studeret til nærmere som en DNA oxidation biomarkør trods eksistensen af multiple DNA oxidationsprodukter 3. Hos mennesker kan denne skade repareres via basen excision reparation ved 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Hvis ikke repareres, kan 8-oxo-dGuo bidrager til dannelsen af basepar-substitutionsmutationer (dvs. G til T transversioner) 4. Vigtigere, 8-oxo-dGuo er en etableret markør for DNA-skader i forhold til initiering og fremme af carcinogenese 2. Derfor nøjagtig kvantificering af 8-oxo-dGuo er en nyttig og ønskelig biomarkør for oxidativ DNA-skade 5.

Der er udbredt forvirring i litteraturen vedrørende de korrekte navne for oxidativt-beskadigede former af 2-deoxyguanosin og desuden det korrekte navn for forbindelsen (r) rutinemæssigt målt som biomarkør for oxidativ DNA-skade 6. De 6,8-diketo og 6-enol, 8-keto tautomere former af 8-oxo-dGuo (vist i figur 1) er de to mest fremtrædende tautomerer omtales i litteraturen 5,7. Den 6,8-diketo formular er den mest fremtrædende form ved fysiologisk pH på 7,4, og er den mest fremtrædende DNA oxidationsprodukt 7. Derfor, 8-oxo-dGuo, snarere end 8-hydroxy-dGuo er den mest passende navn for dette oxidationsprodukt 6. Det er også vigtigt at bemærke, at 2-deoxyguanosin (dGuo), snarere end nucleobase guanin (Gua) eller ribonucleosid guanosin (Guo) henholdsvis detekteres ved de fleste metoder 6.

Nøjagtig påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo er udfordrende på grund af: i) variation i fordøjelsen af DNA-prøven, ii) utilsigtet oxidation af dGuo til 8-oxo-dGuo som kan forekomme under prøveforberedelse, og iii) behovet for effektiv validering af den analytiske HPLC-ED-metoden 8. I denne protokol, vi sigter mod at opnå i) ved at skabe vilkår, gunstige for komplet DNA fordøjelse og ii) ved inddragelse metalchelatoren og chelator-behandlede løsninger og en særlig DNA-isolerende reagens, mens iii) blev kun delvist behandles i inddragelse af positive kontroller og således tilvejebringer, at fremgangsmåden er i stand til at detektere 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Yderligere validering er uden for rammerne af dette papir. Men vi er overbeviste om, at denne protokol vil hjælpe den potentiellebrugere bestemme, i hvilket omfang de skal formelt godkende protokollen, afhængigt af deres formål. En liste over trin, der kræves for den formelle validere metoden tilvejebringes yderligere. Under udvikling og implementering af en metode til 8-oxo-dGuo afsløring, blev offentliggjort metoder revideret og konsolideret. Således er denne metode eliminerer behovet for at indsamle oplysninger fra flere offentliggjorte kilder, der ofte mangler vigtige eksperimentelle detaljer og giver samtidig hurtige og ligetil hjælp af test, hvis metode til påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo er blevet vedtaget med succes. Denne tilpassede metode blev anvendt med succes analysere DNA-prøver fra dyrkede celler og murine væv. Denne video artikel vil hjælpe andre grupper med at etablere en effektiv metode til pålidelig detektion og kvantificering af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.

Protocol

Sikre, at alle dyrehold, bolig, håndtering og eksperimentering overholde lokale regler og bestemmelser, og at eksperimenter protokoller er godkendt forud for påbegyndes undersøgelsen. For de beskrevne eksperimenter blev dyr pleje, håndtering og behandling er godkendt af Health Canada Animal Care udvalget. Se "Reagenser tabellen" for leverandørernes oplysninger. 1. Indsamling Biologiske prøver Celler eller animalske væv Grow humane alveolære adenocarcinom…

Representative Results

dGuo blev observeret at have en retentionstid på 4,7 min mens 8-oxo-dGuo havde en retentionstid på ca. 6,4 min (figur 2A og B). Der er omkring 1000 gange forskel i tophøjderne mellem de to analytter, som det ses i figur 2C. Voltammogrammer for 8-oxo-dGuo og dGuo blev opnået ved kørende standarder på en arbejdende potentiale i intervallet 0,2-1,1 V. Den optimale arbejder potentiale for 8-oxo-dGuo blev bestemt til at være +0,5 V og 0,9 V for dGuo (figur 3)….

Discussion

Selvom 8-oxo-dGuo er blevet rapporteret som en nyttig biomarkør for DNA oxidation, kan dens pålidelig kvantificering en udfordring. Selvom der findes adskillige offentliggjorte metoder, er der behov for en omfattende, beskrivende oversigt over protokol til at tillade forskere at implementere metoden i deres laboratorier. Her præsenterer vi en detaljeret oversigt over en HPLC-baseret protokol, der vil tillade nye brugere til at etablere en effektiv metode til 8-oxo-dGuo detektion og kvantificering.

<p class="jove_…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev finansieret af Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) og den canadiske Regulatory strategi for bioteknologi (CRSB). Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Materials

8-oxo-dGuo standard Cayman Chemical Company 89320 Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details
Alkaline phosphatase  Sigma-Aldrich P5931 From E.coli
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate Sigma-Aldrich D9533
dGuo standard Sigma-Aldrich D7145
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9390
DNA from salmon sperm Sigma-Aldrich D1626 Sodium salt
DNase I Sigma-Aldrich D4527 TypeII, from bovine pancreas
DNAzol Invitrogen 10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E4884 The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH
F12-K media ATCC 30-2004
Foetal bovine serum ATCC 30-2020
Guard column Chromatographic Specialties YBA 99S03 0204GC Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Monobasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered saline Invitrogen 15190-250
Phosphodiesterase I enzyme  Sigma-Aldrich P3243 Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer Thomas Scientific 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin Invitrogen 15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica Chromatographic Specialties YBA 99S03 1546WT

References

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  13. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  14. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  15. Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  16. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  17. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  18. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  19. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  20. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  21. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  22. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  23. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  24. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  25. . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
check_url/52697?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Chepelev, N. L., Kennedy, D. A., Gagné, R., White, T., Long, A. S., Yauk, C. L., White, P. A. HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues. J. Vis. Exp. (102), e52697, doi:10.3791/52697 (2015).

View Video