Målet med denne protokol er påvisningen af DNA oxidation markering, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo) ved HPLC-DE, i DNA fra dyrkede celler eller dyrevæv.
Oxidativt stress er forbundet med mange fysiologiske og patologiske processer, samt xenobiotisk metabolisme, hvilket fører til oxidation af biomakromolekyler, herunder DNA. Derfor er det vigtigt for en række forsknings- discipliner, herunder medicin og toksikologi effektiv detektion af DNA oxidation. En fælles biomarkør for oxidativt beskadiget DNA er 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo, ofte fejlagtigt betegnet som 8-hydroxy-2'-deoxyguanosin (8-OH-dGuo eller 8 -oxo-dG)). Adskillige protokoller til 8-oxo-dGuo måling ved højtryksvæskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ED) er blevet beskrevet. Imidlertid blev disse hovedsagelig anvendes til oprenset DNA behandlet med pro-oxidanter. Hertil kommer, på grund af metodologiske forskelle mellem laboratorier, primært på grund af forskelle i analyseudstyr, vedtagelse af publicerede metoder til påvisning af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED kræver omhyggelig optimering af hvert laboratorium. Enomfattende protokol, som beskriver en sådan optimeringsproces, mangler. Her er en detaljeret protokol beskrevet for påvisning af 8-oxo-dGuo ved HPLC-DE, i DNA fra dyrkede celler eller dyrevæv. Det illustrerer, hvordan forberedelse DNA-prøve kan let og hurtigt optimeret til at minimere uønsket DNA oxidation, der kan forekomme under forberedelsen. Denne protokol viser, hvordan man kan opdage 8-oxo-dGuo i dyrkede humane alveolære adenocarcinomceller (dvs. A549-celler) behandlet med oxidationsmidlet KBrO 3, og fra milten af mus udsat for den polycykliske dibenzo aromatisk carbonhydrid (def, s) chrysen (DBC, tidligere kendt som dibenzo (a, l) pyren, DalP). Samlet set dette arbejde illustrerer, hvordan en HPLC-ED metode kan let optimeres til påvisning af 8-oxo-dGuo i biologiske prøver.
Reaktive ilt arter (ROS), hvis steady state niveauer kan stige under mange patologiske tilstande og xenotoxic stofskifte, bidrager til en øget frekvens af oxidative DNA-skader. Blandt flere mulige nukleobaser oxidationsprodukter kan let måles, oxidativ DNA-beskadigelse bruge den stabile markør 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dGuo), som er en af de oxiderede former af 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo er den mest udbredte DNA læsion 2, og derfor er blevet studeret til nærmere som en DNA oxidation biomarkør trods eksistensen af multiple DNA oxidationsprodukter 3. Hos mennesker kan denne skade repareres via basen excision reparation ved 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Hvis ikke repareres, kan 8-oxo-dGuo bidrager til dannelsen af basepar-substitutionsmutationer (dvs. G til T transversioner) 4. Vigtigere, 8-oxo-dGuo er en etableret markør for DNA-skader i forhold til initiering og fremme af carcinogenese 2. Derfor nøjagtig kvantificering af 8-oxo-dGuo er en nyttig og ønskelig biomarkør for oxidativ DNA-skade 5.
Der er udbredt forvirring i litteraturen vedrørende de korrekte navne for oxidativt-beskadigede former af 2-deoxyguanosin og desuden det korrekte navn for forbindelsen (r) rutinemæssigt målt som biomarkør for oxidativ DNA-skade 6. De 6,8-diketo og 6-enol, 8-keto tautomere former af 8-oxo-dGuo (vist i figur 1) er de to mest fremtrædende tautomerer omtales i litteraturen 5,7. Den 6,8-diketo formular er den mest fremtrædende form ved fysiologisk pH på 7,4, og er den mest fremtrædende DNA oxidationsprodukt 7. Derfor, 8-oxo-dGuo, snarere end 8-hydroxy-dGuo er den mest passende navn for dette oxidationsprodukt 6. Det er også vigtigt at bemærke, at 2-deoxyguanosin (dGuo), snarere end nucleobase guanin (Gua) eller ribonucleosid guanosin (Guo) henholdsvis detekteres ved de fleste metoder 6.
Nøjagtig påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo er udfordrende på grund af: i) variation i fordøjelsen af DNA-prøven, ii) utilsigtet oxidation af dGuo til 8-oxo-dGuo som kan forekomme under prøveforberedelse, og iii) behovet for effektiv validering af den analytiske HPLC-ED-metoden 8. I denne protokol, vi sigter mod at opnå i) ved at skabe vilkår, gunstige for komplet DNA fordøjelse og ii) ved inddragelse metalchelatoren og chelator-behandlede løsninger og en særlig DNA-isolerende reagens, mens iii) blev kun delvist behandles i inddragelse af positive kontroller og således tilvejebringer, at fremgangsmåden er i stand til at detektere 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Yderligere validering er uden for rammerne af dette papir. Men vi er overbeviste om, at denne protokol vil hjælpe den potentiellebrugere bestemme, i hvilket omfang de skal formelt godkende protokollen, afhængigt af deres formål. En liste over trin, der kræves for den formelle validere metoden tilvejebringes yderligere. Under udvikling og implementering af en metode til 8-oxo-dGuo afsløring, blev offentliggjort metoder revideret og konsolideret. Således er denne metode eliminerer behovet for at indsamle oplysninger fra flere offentliggjorte kilder, der ofte mangler vigtige eksperimentelle detaljer og giver samtidig hurtige og ligetil hjælp af test, hvis metode til påvisning og kvantificering af 8-oxo-dGuo er blevet vedtaget med succes. Denne tilpassede metode blev anvendt med succes analysere DNA-prøver fra dyrkede celler og murine væv. Denne video artikel vil hjælpe andre grupper med at etablere en effektiv metode til pålidelig detektion og kvantificering af 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.
Selvom 8-oxo-dGuo er blevet rapporteret som en nyttig biomarkør for DNA oxidation, kan dens pålidelig kvantificering en udfordring. Selvom der findes adskillige offentliggjorte metoder, er der behov for en omfattende, beskrivende oversigt over protokol til at tillade forskere at implementere metoden i deres laboratorier. Her præsenterer vi en detaljeret oversigt over en HPLC-baseret protokol, der vil tillade nye brugere til at etablere en effektiv metode til 8-oxo-dGuo detektion og kvantificering.
<p class="jove_…The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) og den canadiske Regulatory strategi for bioteknologi (CRSB). Forfatterne har ingen interessekonflikter.
8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |