Isolering av Neural Stem / stamceller fra periventricular Region of Adult Rat and Human Spinal Cord
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Voksen rotte og menneske ryggmarg nevrale stilk / stamceller (NSPCs) dyrket i vekstfaktor-beriket medium muliggjør spredning av multipotent, selvfornyende og utvid nevrale stamceller. I serum forhold, vil disse multipotente NSPCs differensiere, genererer nevroner, astrocytter og oligodendrocytter. Den høstet vev er enzymatisk dissosiert i et papain-EDTA-oppløsning og deretter mekanisk dissosiert og separeres gjennom en diskontinuerlig densitetsgradient for å gi en enkeltcelle-suspensjon som er belagt i Neurobasal medium supplert med epidermal vekstfaktor (EGF), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF ), og heparin. Voksen rotte ryggmargs NSPCs dyrkes som frittflytende neurosfærer og voksen menneskeryggmargs NSPCs dyrkes som tilhenger kulturer. Under disse forholdene, voksne ryggmargs NSPCs spre seg, uttrykke markører for forløperceller, og kan kontinuerlig utvides ved passering. Disse cellene kan be studert in vitro i respons til forskjellige stimuli, og eksogene faktorer kan anvendes for å fremme avstamning begrensning for å undersøke neurale stamcelledifferensiering. Multipotent NSPCs eller deres avkom kan også bli transplantert inn i ulike dyremodeller for å vurdere regenerativ reparasjon.
Introduction
NSPCs er multipotente celler forpliktet til nevrale avstamning som kan selv fornye og lett utvide in vitro. Vi viser til disse cellene som en blandet befolkning av nevrale stilk / stamceller siden de vise egenskaper av selvfornyende multipotente stamceller og mer begrenset stamfedre. NSPCs finnes i både fosterets og voksen hjerne og ryggmarg 1,2. I voksen, NSPCs er normalt sovende og ligge innenfor bestemte nisjer inkludert subventricular sonen fôr sideventriklene 2-4, og periventricular regionen rundt sentralkanalen i ryggmargen 5,6.
Vanligvis NSPCs dyrkes som frittflytende neurosfærer eller som tilhenger monolag i serumfritt medium supplert med EGF og bFGF, mitogener som selekterer for stammen / stamcellepopulasjoner. Neurosfærene analysen opprinnelig utviklet av Reynolds og Weiss 2, er mest brukt til kultur ogutvide nevrale stamceller. NSPCs viser multipotency når de er belagt i vekstfaktor-fritt medium inneholdende serum, å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Multipotent, kan selvfornyende NSPCs isoleres og dyrkes fra den voksne gnager ryggmargen når dyrkede vevet omfatter områder av sentralkanalen 6,7. En potensiell fordel i å bruke NSPCs generert fra den voksne ryggmargen i motsetning til å generere celler fra andre regioner er at disse vevsspesifikke celler ligne celler i ryggmargen som er tapt eller skadet etter skade eller sykdom tettest.
Tidligere arbeid har vist at neurosfærer avledet fra den humane ryggmargen ikke kunne forplante seg langvarig eller passert for å generere tilstrekkelig antall celler 8,9. Men med modifikasjoner i dyrkningsforhold, rapporterte vi utvidelse og transplantasjon av voksne mennesker ryggmargs-avledet NSPCs, viser at selvfornyendeog multipotente NSPCs kan isoleres fra voksent menneske ryggmargen av organtransplanterte givere 10. Primært, fjerning av det meste av hvit substans under disseksjonen og dyrkning av disse cellene på en adherent substrat i vekstfaktor-anriket medium valgt for prolifererende voksent menneske ryggmarg NSPCs. I denne protokollen beskriver vi høsting av ryggmargen fra voksen rotte og fra menneskelige organtransplanterte givere, disseksjon av periventricular vev, og isolasjon, kultur og utvidelse av NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under disseksjon av rotte ryggmarg vev forsiktighet bør utvises for ikke å skade ryggmargen mens du utfører laminektomi. Det er lettere å isolere periventricular vevet når ryggmargssegmenter er intakte. Vevet segmentene bør være fullt nedsenket i disseksjon buffer og de overliggende hjernehinnene og hvit substans kan bli kuttet bort som langsgående striper med microscissors. Alternativt kan fint vev tang brukes til å skrelle hvit substans unna.
For isoleringsprosedyren for NSPCs det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).
