Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
I hvirveldyr, er hæmatopoiese reguleres af induktive mikromiljøer (nicher). Ligeledes i hvirvelløse model organisme Drosophila melanogaster, induktive mikromiljøer kendt som larver Hæmatopoietiske Lommer (HPS) er blevet identificeret som anatomiske steder for udvikling og regulering af blodlegemer (hæmocytter), navnlig af selvfornyende makrofag afstamning. HPS er segmentarisk gentagne lommer mellem epidermis og muskellag af larve, der også dækker sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. I larve, er hjemmehørende (fastsiddende) hæmocytter udsat for anti-apoptotiske, klæbemiddel og proliferative signaler fra disse sensoriske neuroner og potentielt andre bestanddele af HPS, såsom foring muskler og epiteliale lag. Under normal udvikling, gradvis frigivelse af hjemmehørende hæmocytter fra HPS brændsler befolkningen i cirkulerende hæmocytter, som kulminerer i frigivelsen af most af de bosiddende hæmocytter i begyndelsen af metamorfose. Immune overgreb, fysisk skade eller mekanisk forstyrrelse udløse tidlig frigivelse af hjemmehørende hæmocytter i omløb. Kontakten af larver hæmocytter mellem hjemmehørende steder og cirkulation hæver behovet for en fælles standard / procedure til selektivt at isolere og kvantificere disse to populationer af blodceller fra enkelt Drosophila larver. Derfor denne protokol beskriver en automatiseret metode til at frigøre og kvantificere beboeren og cirkulerende hæmocytter fra enkelt larver. Metoden letter ex vivo metoder, og kan tilpasses til at tjene en række forskellige udviklingsstadier af Drosophila og andre hvirvelløse organismer.
Forskning i hvirvelløse model Drosophila melanogaster har drevet opdagelsen af medfødte immunitet 1, og har lettet forståelsen af forskellige aspekter blodlegemer udvikling på 2-4. Drosophila hæmatopoiese kan opdeles i afstamning af embryonale / larve hæmocytter, som har oprindelse i den embryoner og ekspandere i larve, og afstamning af lymfe kirtel hæmocytter 4,5. Her præsenterer vi en protokol, der fokuserer på den slægt af embryonale / larver hæmocytter, som i Drosophila larve hovedsageligt omfatter plasmatocytes (makrofager) og få krystal celler 4. I larve, hæmocytter af embryo fortsætter og kolonisere segmentvis gentagne og terminal Hæmatopoietiske lommer (HPS) placeret mellem epidermis og muskel lag af larvestadiet kroppen væggen 5,6. Baseret på deres natur som selvstændige forny makrofager 6, deres dominerende bopæl i lokale væv mikromiljøer 6, 7 og deres slægt fra de tidligste blodlegemer nye under udviklingen 6,8, er dette blod cellepopulation for at svare til hvirveldyr selvfornyende væv makrofager, en uafhængig myeloid herkomst nylig identificeret i en række forskellige arter 4,9,10. Men i Drosophila, nogle af eller alle disse residente celler viser også plasticitet at give anledning til andre blodcelletyper såsom krystal celler 11,12.
Larver hæmocytter er overvejende resident (siddende), men er i en dynamisk ligevægt mellem de forskellige HPS. De er gradvist frigives i omsætning, især med den 3. stadiums larve nærmer pupariation 5-7. Immune udfordringer, skader eller mekaniske forstyrrelser fører til en for tidlig, i sidstnævnte tilfælde reversible, mobilisering af hjemmehørende hæmocytter ind i hæmolymfe 4,6,13.
Tidligere undersøgelser har antydet, at hjemmehørende og cirkulerendelarval hæmocytter er af samme slægt, men adskiller sig i deres klæbende eller målsøgende egenskaber 6,7,13,14. Selektiv isolation af cirkulerende versus hjemmehørende hæmocytter afslørede forhøjede niveauer af proliferation i den fastboende hemocyte befolkning, hvilket tyder på deres eksponering for induktive signaler fra HPS 6. Drosophila larver HPS er foret af epidermis og muskellag og videre havnen sensoriske neuron klynger af det perifere nervesystem (PNS) og leverfunktionen ligner oenocytes 6. Funktionelt har mutante og genetiske celle ablation forsøg viste, at sensoriske neuroner til stede i HPS støtte trofiske overlevelse og lokalisering af larver hæmocytter 6.
Her beskriver vi en metode til den specifikke isolering og kvantificering af hjemmehørende og cirkulerende hæmocytter fra enkelt Drosophila larver, og en protokol for mekanisk hemocyte mobilisering. Fremgangsmåderne kan anvendes til ex vivoundersøgelse af hæmocytter og kan desuden tilpasses til andre Drosophila udviklingsstadier såsom puppe og voksen og andre hvirvelløse systemer. Da tidligere undersøgelser ikke skelnede mellem bopæl og cirkulerende hæmocytter, denne protokol giver en fælles standard for studiet af hjemmehørende blodceller og vil bidrage til at øge sammenhængen i hvirvelløse blodlegemer forskning.
For det første Hemocyte Bleed / Skrab-analysen beskriver forskellen isolation og automatiseret kvantificering af fluorescerende protein-mærket hjemmehørende og cirkulerende hemocyte befolkninger mod enkelt Drosophila larver; protokollen giver to muligheder for regelmæssige og fliser scan udstyrede mikroskoper (figur 1). Som et resultat, er den procentdel af cirkulerende hæmocytter og det samlede antal hæmocytter pr larve opnået. Metoden bygger på transgene Drosophila larver, der udtrykker fluorescerende protein blandt deres blodlegemerbefolkning. Valget af hemocyte driver eller reporter bestemmer udfaldet, dvs. som population af blodlegemer, visualiseres og kvantificeres. At mærke hovedsageligt makrofager (plasmatocytes), som omfatter langt størstedelen af beboeren og cirkulerende hemocyte befolkning i Drosophila larve 6, egnede transgener omfatter Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXn -GAL4 16, CRQ-GAL4 (ved H. Agaisse 16) eller eater-GAL4 17; til mærkning af relativt lille population af krystal celler, egnede linjer er BcF6-fælles fiskeripolitik og -GFP 18, eller LZ-GAL4 (ved J. Pollock 19), for mærkning lamellocytes, en specialiseret celletype hovedsageligt fremkaldt af immune udfordringer og skader 13, De må f.eks MSNF9mo-mCherry anvendes 17. Nogle transgene drivere er udtrykt i en række differentieret blodceller og stamceller, såsom han – GAL4 20, som etiketter omkring 80% af alle larver blodceller 20. Bemærk, at i alle tilfælde, hvor der anvendes GAL4 drivere kombination med UAS-GFP eller en anden fluorescerende protein UAS-transgen er påkrævet. I afsnittet Resultater, anvendes denne metode til at overvåge erythrocyttallet og opførsel omsætning i løbet af larveudvikling.
For det andet Hemocyte Forstyrrelse analysen beskriver et foregående trin designet til at løsne residente hæmocytter ved ekstern manipulation, som efterfølgende muliggør evaluering af evnen hæmocytter at re-klæber og hjem til HPS inden for en begrænset tidsramme (30 – 60 min) 6. Typisk dette assay efterfølges af Bleed / skrab assay for at bestemme procentdelen af cirkulerende hæmocytter pr larve. Vi præsenterer en forenklet protokol for denne analyse (figur 1D), som bruger forstyrrelser ved hvirvelbehandling with glasperler, snarere end manipulation af en enkelt larve med en pensel som beskrevet tidligere 6. I afsnittet Resultater er denne analyse bruges til at vise, at forbigående fritliggende hæmocytter flyde i hæmolymfe og kan genfindes i den del af cirkulerende hæmocytter. Analysen er også nyttigt at kvantificere forskelle hæmocytter i deres målsøgende / vedhæftning til hjemmehørende sites, sammenligner fx forskellige genetiske baggrunde eller stimulation betingelser. Bemærk, at denne mekaniske manipulation afspejler en reversibel proces, og er forskellig fra Infektion eller skade-induceret bosiddende hemocyte mobilisering, som typisk ikke er reversible i en kort tidsramme 4,13.
Her beskriver vi den første metode til kvantitativ genvinde hjemmehørende og cirkulerende blodceller fra enkelt Drosophila larver, og kvantificere disse to hemocyte befolkninger. Protokollen omfatter den sekventielle frigivelse af cirkulerende og bosiddende blodceller, efterfulgt af billedbehandling og automatiseret celletælling. Larver hjemmehørende hæmocytter kan forbigående mobiliseres i omløb af mekanisk forstyrrelse, en proces, der er kendt for at være stort set vendt inden for en 30-60 min restitutionsperiode 6. Følgelig blev denne protokol testet på to måder: (1) ved at vurdere det samlede hemocyte antal pr larve og fraktion af cirkulerende hæmocytter løbet af larveudvikling, og (2) ved eksperimentelt at løsne residente hæmocytter anvendelse af en automatiseret fremgangsmåde, som bekræftede stram korrelation af hemocyte lokalisering og hemocyte nummer i hjemmehørende og cirkulerende befolkninger. Desuden blev reproducerbarheden af fremgangsmåden påvises ved comparing to datasæt af biologiske gentagelser.
Tidligere har laboratorier anvendt en række teknikker til at kvantificere larvernes hæmocytter 6,13,21. Denne protokol fastlægges en fælles standard for at hente og kvantificere hjemmehørende og cirkulerende blod cellepopulationer fra Drosophila larver, hvilket giver en let at tilpasse platform. Den beskrevne metode er afgørende for undersøgelser, der fokuserer på den rolle, som hjemmehørende hæmocytter og deres mikromiljø, hæmatopoietisk Pockets 4-6, og er velegnet til at studere fluorescerende protein transgene-transporterer Drosophila stammer i vildtype og genetisk modificerede baggrunde. Protokollen er også relevant for undersøgelser, der fokuserer på hemocyte mobilisering efter immun udfordring eller skade, og genetisk eller miljømæssigt induceret signalering, der udløser mobilisering af hjemmehørende hæmocytter eller ændringer i den samlede hemocyte nummer (revideret i 4). Det skal bemærkes, at i tilfælde af for tidlig differentiation og frigivelse af hæmocytter fra lymfe kirtel, idet der skelnes embryonale / larver versus lymfeknuder kirtel slægter kan være begrænset af udtrykket mønster af fluorescerende hemocyte reporter anvendes.
Protokollen præsenteres her bygger på billedbehandling levende, fluorescens-mærkede hæmocytter. I fremtiden kan det modificeres for at tillade detektion af de frigivne celler efter fiksering, f.eks, ved hjælp af immuncytokemi. I dette tilfælde kan protokollen skal tilpasses for at sikre fuldstændig adhæsion af blodlegemer, for eksempel ved at øge adhæsion inkubationstider og tilsætning klæbende glassets belægning, såsom concanavalin A. Da metoden tillader udtagning af hæmocytter og deres manipulation ex vivo, vil det gavne en lang række udviklingsmæssige, cellebiologiske og biokemiske undersøgelser. Resident og cirkulerende blodceller findes i alle postembryonic udviklingsmæssige stadier af Drosophila og andre hvirvelløse dyr 22, suggesting, at tilpasningen af denne metode vil gavne en bred vifte af undersøgelser uden for Drosophila larve hæmatopoietiske system.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jesper Kronhamn og Dan Hultmark, Michael Galko, og Bloomington Stock Center for flyve bestande. Særlig tak til Courtney Onodera for rådgivning med statistisk analyse. Vi takker Katrina Guld til kritisk læsning af manuskriptet, og Kalpana Makhijani, Katrina Gold, medlemmer af Derynck laboratorium og medlemmer af Nystul laboratorium for diskussion og kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra UCSF Program for Gennembrud Biomedical Research (PBBR), Bred Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 og 1R56HL118726-01A1 (i KB).
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |