माउस भोले सीडी 4<sup> +</sup> टी सेल अलगाव और<em> इन विट्रो</em> टी सेल सबसेट में भेदभाव
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
अलग प्रजातियों या सीडी 4+ टी सहायक के सबसेट की अवधारणा (ध) कोशिकाओं को 20 वीं सदी के एक के बाद के हिस्से के बाद से आसपास किया गया है। सेलुलर प्रसार और कोशिकाओं गु प्रेरक में अंतिम भेदभाव के कई दौर में costimulatory संकेतों परिणामों की उपस्थिति में आत्मीय प्रतिजन की मान्यता। इस प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न गु सेल के प्रकार के सक्रियण 2 के दौरान उपस्थित साइटोकाइन पर्यावरण पर निर्भर है। प्रारंभ में, भोले गु कोशिकाओं टी सेल रिसेप्टर (TCR) सक्रियण, costimulatory CD28 बंधाव, और साइटोकाइन संकेतन निम्नलिखित दो अलग प्रजातियों में फूट डालना लगा रहे थे। टाइप 1 सहायक कोशिकाओं (Th1) IFNγ साइटोकाइन के अपने प्रेरक उत्पादन के साथ-साथ भेदभाव प्रक्रिया 3,4 दौरान आईएल-12 संकेतन के लिए उनकी आवश्यकता की विशेषता है। अंततः यह विभेदित Th1 कोशिकाओं सबसे विशिष्ट बी की विशेषता है कि एक आनुवंशिक प्रोफ़ाइल है कि खोज की थीY Th1 आनुवंशिक कार्यक्रम 5 के मास्टर नियामक माना जाता है जो टी बॉक्स परिवार प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति, Tbx21 (टी शर्त),। इसके अलावा, आईएल-12 के रूप में अच्छी तरह से IFNγ के रूप में टी-शर्त अभिव्यक्ति 6,7 प्रचार कर सकते हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में, Th1 कोशिकाओं इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ों के साथ ही स्व-प्रतिरक्षित सूजन की मजबूत प्रमोटरों के खिलाफ मेजबान सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, टाइप 2 सहायक कोशिकाओं (Th2) उनके विकास के लिए आईएल -4 और आईएल -4, आईएल -5 सहित उनके प्रेरक साइटोकिन्स, और आईएल -13 की आवश्यकता होती है, बी सेल प्रतिक्रिया ड्राइविंग के लिए महत्वपूर्ण हैं और एलर्जी 8 में रोगजनक हैं, 9। Th1 कोशिकाओं के लिए इसी प्रकार, Th2 कोशिकाओं को उनके खुद के मालिक ट्रांसक्रिप्शनल नियामक व्यक्त करने के लिए पाए गए, GATA-तीन 10,11 करार दिया। दिलचस्प बात यह है ध्रुवीकरण साइटोकिन्स की उपस्थिति और एक विशिष्ट गु वंश की पीढ़ी केवल एक विशेष गु सबसेट एक प्रतिरक्षा पुन दौरान प्रमुख बन सकते हैं, सुझाव है कि दूसरों को 2,12 के विकास के लिए विरोधी हैंप्रायोजक।
Th1 और Th2 प्रजातियों की पहचान के बाद से, आगे काम हाल ही में कूपिक सहायक (TFH), (Th9) आईएल-9-उत्पादन और आईएल-22-उत्पादन (Th22) (सहित टी सहायक कोशिकाओं के भी अद्वितीय कैंपेन्स, प्रदर्शन किया है ) 13 में समीक्षा की। इन विट्रो भेदभाव प्रयोगों के प्रयोजनों के लिए, इस प्रोटोकॉल विनियामक टी कोशिकाओं (Treg) और आईएल-17-उत्पादन सीडी 4+ टी कोशिकाओं (Th17) कहा जाता है, केवल पर दो अतिरिक्त गु कैंपेन्स ध्यान दिया जाएगा। CD25 + विनियामक टी कोशिकाओं थाइमस में स्वाभाविक रूप से (nTreg) हो सकता है; भोले गु कोशिकाओं को भी (14,15 में समीक्षा) परिधि में नियामक बनने के लिए (iTreg) प्रेरित किया जा सकता है। Tregs के दोनों प्रकार के एक विशेषता प्रतिलेखन कारक, घुलनशील विरोधी भड़काऊ मध्यस्थ उत्पादन, आईएल -2 की खपत, और सेल संपर्क निर्भर तंत्र 14,15 शामिल है कि उनके प्रेरक दमन तंत्र के लिए महत्वपूर्ण है जो forkhead बॉक्स पी 3 (Foxp3), करार दिया व्यक्त करते हैं। Foxp की कमीएक गंभीर, बहु अंग autoimmune विकार में 3 अभिव्यक्ति परिणाम प्रतिरक्षा अनियंत्रण, polyendocrinopathy, enteropathy करार दिया, सूजन को हल करने और आत्म करने के लिए परिधीय सहिष्णुता को विनियमित करने में इस गु सबसेट की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन एक्स-लिंक्ड सिंड्रोम (IPEX), 16 प्रतिजनों। इन विट्रो में, भोले सीडी 4+ टी सहायक कोशिकाओं Foxp3 अप को विनियमित करने और आईएल -2 और 14,15 TGF-β साथ उत्तेजना पर Treg कार्यक्रम के लिए प्रतिबद्ध हो जाते हैं। (17,18 में समीक्षा) केवल साइटोकाइन उत्पादन पर है, खासकर जब सीडी 4 + टी सेल प्रजातियों में काफी plasticity के लिए उदार हो सकता है। हालांकि, इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, हम एक अद्वितीय वंश के रूप में प्रत्येक सबसेट पर चर्चा होगी।
हाल ही में, आईएल-17 साइटोकाइन है कि उत्पादन Th17 कोशिकाओं के एक सबसेट स्व-प्रतिरक्षित सूजन 19-21 के दौरान विशेष रूप से रोगजनक हैं कि समर्थक भड़काऊ कार्यों के साथ एक अद्वितीय वंश के रूप में पहचान की गई थी। Th17 कोशिकाओं को एक अद्वितीय प्रतिलेखन कारक एक्सप्रेस, Th17 आनुवंशिक कार्यक्रम 22 निर्देशांक कि करार दिया retinoid से संबंधित अनाथ रिसेप्टर गामा T (RORγt)। TGFβ RORγt की प्रेरण के माध्यम से Th17 वंश की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, TGFβ संकेतन का असर केवल (12 में समीक्षा) आईएल -6 के साथ भागीदारी पर Th17 प्रतिबद्धता प्रेरित करने के लिए माना जाता है। आगे के अध्ययन के अन्य सकारात्मक आईएल 1β सहित Th17 प्रतिबद्धता को नियंत्रित कर सकते हैं कि संकेतों में वृद्धि हुई, सोडियम, और TLR की एक किस्म 23-26 संकेत दिखाया है। अन्य रिपोर्टों विवो में रोगजनक Th17 कोशिकाओं को वास्तव में TGFβ सिगनल को बायपास करने वाले लोग कर रहे हैं और इसके बजाय उनके भेदभाव 27 के लिए आईएल -1, आईएल -6, और आईएल -23 का एक संयोजन पर निर्भर है कि सुझाव दिया है। इस प्रकार, Th17 कोशिकाओं रास्ते संकेतन की एक किस्म से प्राप्त किया जा सकता है; Th17 वंश प्रतिबद्धता के लिए इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, सामान्य रूप से प्रयुक्त (TGFβ और आईएल -6) मार्गप्रस्तुत किया जाएगा।
सभी प्रेरक प्रजातियों के लिए नीचे वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल प्रयोग का पूरा कोर्स में TCR और CD28 के लिए उत्तेजनाओं के रूप में तय एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। हालांकि, दूसरों को दिखा दिया है कि प्रतिजन कोशिकाओं पेश 28 या पार से जोड़ने विरोधी CD3 और हम्सटर एंटीबॉडी के साथ विरोधी CD28 एंटीबॉडी दो दिनों में 29 के लिए भी विभिन्न गु कैंपेन्स की पीढ़ी के उत्प्रेरण के अत्यधिक प्रभावी साधन हैं साथ TCR के सक्रियण। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल Th17 कोशिकाओं 31 माध्यमिक ल्य्म्फोइड अंगों 30 से murine सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग-थलग और पैदा करने के लिए पहले की रिपोर्ट के तरीकों पर बनाता है। एक प्रमुख अंतर यह है कि इस प्रोटोकॉल ल्य्म्फोइड ऊतकों से भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल सॉर्टर के उपयोग पर निर्भर करता है। हालांकि, कई कंपनियों को अब आवश्यकता च बायपास करने में सक्षम हो सकता है, जो भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध कर सकते हैं कि तेजी से जुदाई किट की पेशकशया छँटाई प्रयोग पर निर्भर करता है। तरीकों और इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत अभिकर्मकों हम नियमित रूप से इस्तेमाल करते हैं और सबसे प्रभावी होने के लिए मिल रहे हैं। हालांकि, वैकल्पिक अभिकर्मकों और तरीके से नीचे प्रस्तुत चरणों के कई के लिए मौजूद हैं कि मन में रखने के लिए और यह अपने उद्देश्यों के लिए सबसे अच्छा काम करेगा निर्धारित करने के लिए अलग-अलग प्रयोगशाला पर निर्भर है।
Protocol
Representative Results
Discussion
तिल्ली भोले गु सेल शामिल हैं, जबकि लिम्फ नोड्स में इस आबादी का अनुपात बहुत अधिक है। ठीक से इस प्रोटोकॉल में लिम्फ नोड्स की पहचान करने और निकालने के लिए विफलता भोले कोशिकाओं के एक गरीब उपज में परिणाम होग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए टेक्सास एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय में चिकित्सा और विज्ञान के रॉसलिंड फ्रैंकलिन विश्वविद्यालय में रेनॉल्ड्स प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, और चेन दांग प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (K22AI104941) से JMR के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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