Viral-mediert Merking og transplantasjon av Medial ganglieblokkere Eminence (MGE) Cells for<em> I Vivo</em> Studier

Summary

Gabaergic kortikal Interneuron stamfedre spre seg, utvikle og postsynaptisk integrere i en verts cortex etter transplantasjon. Disse cellene kan lett omformet før transplantasjon for in vivo studier av genmodifiserte gabaergic forløpere. Her viser vi viral merking teknikker for å målrette bestemte Interneuron undergrupper ved hjelp av eksisterende Grobunn linjer og Cre-avhengige journalister.

Abstract

Gabaergic kortikale interneuroner, avledet fra embryonale mediale og caudal ganglieblokkere eminenser (MGE og CGE), er funksjonelt og morfologisk mangfoldig. Innhugg har blitt gjort i å forstå rollene til forskjellige Interneuron undergrupper bark, men det er fortsatt mange mekanismer for å bli jobbet ut som kan bidra til utvikling og modning av ulike typer gabaergic celler. Videre kan forandres GABAergic signale bidra til fenotyper av autisme, schizofreni og epilepsi. Spesifikke Cre-driver linjer har begynt funksjonene til unike Interneuron undergrupper å pakke ut. Til tross for fremskritt i musemodeller, er det ofte vanskelig å effektivt studere gabaergic kortikal Interneuron stamfedre med molekylære metoder in vivo. En viktig teknikk som brukes for å undersøke celleautonome programmering av disse cellene er transplantasjon av MGE celler i vertsekser. Disse transplanterte cellene vandrer mye, differensiere, ennd funksjonelt integrere. I tillegg kan MGE celler effektivt transdusert med lentivirus umiddelbart før transplantasjonen, slik at for et mangfold av molekylære tilnærminger. Her har vi detalj en protokoll for å effektivt transduce MGE celler før transplantasjon for in vivo analyse, ved hjelp av tilgjengelige Cre-driver linjer og Cre-avhengige ekspresjonsvektorene. Denne fremgangsmåten er fordelaktig fordi den kombinerer nøyaktig genetisk manipulasjon med evnen til disse cellene for å dispergere etter transplantasjonen, hvilket tillater større celletype spesifikk oppløsning in vivo.

Introduction

Gabaergic kortikale interneuroner omfatter ~ 20-30% av nevroner i pattedyr neocortex, mens resten svarer til eksitatoriske, glutamaterge viktigste nevroner. Interneuroner er svært forskjellige i elektrofysiologisk egenskaper, axon og dendrite morfologi og synaptic målretting ^en, og ubalanser i eksitatorisk / hemmende tone er antatt å ligge til grunn noen fenotyper av nevrologiske / nevropsykiatriske lidelser, inkludert autisme, schizofreni og epilepsi ^2. Det overordnede målet i protokollen beskrevet her er å gi et middel for å effektivt genmodifisere gabaergic kortikale Interneuron stamfedre før transplantasjon for in vivo analyser.

Kortikal gabaergic interneuroner er født i mediale og caudal ganglieblokkere eminenser (MGE og CGE, henholdsvis) ^3,4 samt preoptic område ^5. Kortikale Interneuron stamfedre gjennomgå langdistanse tangential migrasjon fulgtved radial migrasjon for å nå sine endelige mål. Ved ankomst til sine destinasjoner, må disse kortikale interneuroner riktig integrere i eksisterende nevronale nettverk, og hver unike interneuron undergruppe vil bidra til kortikal kretser på bestemte måter. Fire hoved undergrupper kan være preget av molekylære markører: MGE-avledet somatostatin (SST) ⁺ og parvalbumin (PV) ⁺ undergrupper, og CGE-avledet vasoaktive intestinal peptid (VIP) ⁺ og Reelin ^+; SST ^– undergrupper ^6. Ulike Interneuron undergrupper kortikale er født over forskjellige tider under embryonal utvikling i MGE og CGE ^{7, 8.} Disse og andre kortikale gabaergic Interneuron markører har blitt brukt til å generere spesifikke Cre-driver linjer for mange av disse undergruppene ^9-11.

Transplantasjon av MGE stamfedre har dukket opp som en potensiell cellebasert terapi for å behandle lidelser som kan være forårsaket av ubalanseri eksitasjon / hemming ^12-24. Disse terapeutiske fordeler kan skyldes delvis den unike evnen til MGE stamfedre (å spre seg, differensiere og integrere i en rekke hjernen), eller potensielt fordi mange peri-somatiske hemmende PV ⁺ celler er utledet fra MGE. MGE celler kan også være raskt og effektivt transdusert med lentivirus før transplantasjon ^15, slik at celler som er genetisk modifisert in vitro for å bli studert in vivo. Begrunnelsen for å utvikle denne tilnærmingen var å overvinne veisperringer i å studere GABAergic kortikal interneuron utvikling og modning. Spesielt MGE transplantasjon tillates forskere for å studere utviklingen av mutante celler in vivo, når den mutante mus ellers ville ha dødd på et tidlig tidspunkt. Videre, ved innføring av gener som er av interesse før transplantasjon, virkningene av spesifikke gener på en mutant fenotype kan bli vurdert i en efficient måte.

Her gir vi en detaljert protokoll for å transduce MGE celler med lentiviruses før transplantasjon. I tillegg viser vi hvordan denne teknikken kan tilpasses til å uttrykke et gen av interesse i bestemte Interneuron undergrupper fra en heterogen gruppe av cortical Interneuron forløpere, ved hjelp av en kombinasjon av Cre-avhengige uttrykk lentiviruses og tilgjengelige Cre-driver mus linjer. Dessuten introduserer denne protokollen teknikker og en plattform for forskere å genmodifisere gabaergic kortikal Interneuron forløpere for in vivo studier på en unik måte. En fordel med denne teknikken fremfor andre nåværende metoder er at de transplanterte cellene MGE vil spre seg borte fra injeksjonsstedet. Også, i motsetning fokale virale injeksjoner, etter MGE celler spre deres morfologi er lettere å vurdere. Denne tilnærmingen kan brukes for å studere effekten av innføring av gener som er av interesse inn i villtype eller mutante celler, innføring av en celletype spesifikkreporter for å vurdere morfologi, eller eventuelt for å studere effekten av sykdoms alleler in vivo.

Protocol

Etikk uttalelse: Følgende prosedyrer er godkjent av vår institusjon og dyr protokollen. Sørg for å få godkjenning for alle prosedyrer som involverer overlevelses operasjoner før du begynner eksperimenter og kontrollere alle protokoller er oppdatert. 1. Lentivirus Forberedelse (valgfritt trinn) Delt i tre 10 cm plater av HEK293T celler for hver lentivirus å bli gjort, i nærvær av 10 ml DMEM / 10% FBS, og vokse til ~ 60-70% konfluens. Dyrke cellene i en inkubator v…

Representative Results

Siden MGE celler har en unik evne til å migrere og integrere når transplantert inn en rekke neocortex 16, de gir en utmerket modellsystem for genetisk manipulasjon før in vivo studier. Heri viser vi hvordan man kan isolere MGE vev fra E13.5 embryoer (figur 1 og 2), som deretter kan bli transdusert med lentivirus, enten in vitro eller in en hurtig måte før transplantasjon for in vivo-studier. Merking MGE via lentiviruses er utført før du bruker en for…

Discussion

Bruken av gabaergic kortikal Interneuron forløpere fra embryonale ganglieblokkere eminenser (GES) for cellebasert terapi viser lovende for mange forhold ^{12 -1 4.} Presise molekylære teknikker for å spore, og uttrykke gener av interesse i bestemte Interneuron undergrupper. Her har vi gi en detaljert protokoll for merking embryonale MGE celler med lentivirus før transplantasjon, og viser hvordan denne teknikken kan brukes til å uttrykke gener som er av interesse i spesielle Interneuron undergrupper kortikal…

Materials

			Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
301/2 gauge needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler	n.a.	made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil	n.a.	Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
			Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
			Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene