Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen
Summary
We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
Abstract
Locomotive Mängel von neurodegenerativen Erkrankungen resultiert, kann ein später Beginn Symptom der Krankheit, nach Jahren der subklinischen Degeneration und damit aktuelle therapeutische Behandlungsstrategien sind nicht kurativ. Durch die Verwendung von Voll Exoms Sequenzierung, eine zunehmende Anzahl von Genen identifiziert worden, eine Rolle in menschlichen Fortbewegung spielt. Trotz der Identifizierung dieser Gene, ist es nicht bekannt, wie diese Gene sind entscheidend für die normale Bewegungsfunktion. Daher ist ein zuverlässiger Test, der Modellorganismen verwendet, um die Rolle dieser Gene, um neue Targets von therapeutischem Interesse zu identifizieren aufzuklären, ist mehr denn je erforderlich. Wir haben eine sensibilisierte Version der negativen geotaxis Assay, der zum Nachweis von Mängeln milder früheren ermöglicht, und die Fähigkeit hat, diese Mängel über der Zeit erfasst gestaltet. Der Test wird in einem Glas durchgeführt Meßzylinder, der mit einem Wachsbarriere-Film abgedichtet ist. Durch die Erhöhung der Schwellenabstand um 17,5 c bestiegen werdenm und die Erhöhung der Versuchsdauer bis 2 Minuten haben wir eine größere Empfindlichkeit beim Nachweis von mild Mobilitätsstörungen beobachtet. Der Test wird kostengünstig und erfordert keine umfangreiche Ausbildung zu hoch reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Dies macht es eine ausgezeichnete Technik für das Screening von Wirkstoffkandidaten in Drosophila-Mutanten mit Bewegungsfehler.
Introduction
Verheerenden neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose und Spastische Paraplegie werden zunehmend anerkannt. Leider sind die meisten dieser neurodegenerativen Erkrankungen noch ohne Behandlungen. Die weit verbreitete klinische Anwendung von genomweiten, unvoreingenommene Gentests wie Voll Exom-Sequenzierung hat zu einer wachsenden Anzahl von Genen geführt, dass in der menschlichen Bewegungsapparates verwickelt. Trotz dieser Fortschritte die pathologische Progression von früh bis spät Bühnen, in weiter Ferne in dieser Erkrankungen. Drosophila stellt ein mit den genetischen Werkzeuge zum Studium Gen Anforderung in einer kontrollierten Art und Weise räumlich und zeitlich. Darüber hinaus hat Drosophila nützlich beim Screening Medikamenten für neurologische Erkrankungen wie der Parkinson-1, Alzheimer-2, geistiger Behinderung und Epilepsie 3,4 5,6 ua bewährt. Unser Ziel war es, eine kostengünstige Entwicklungund zuverlässigen Assay, der Analyse mit hohem Durchsatz, die noch ausreichend empfindlich gegenüber kleinen Änderungen in der Motorleistung zu detektieren würde ermöglichen würde.
Es gibt verschiedene Tests verwendet, um die Effekte der genetischen Mutation und / oder Umgebungsbedingung auf Drosophila Kletterverhalten zu quantifizieren. Die meisten der Tests zu profitieren auf die natürliche Tendenz von Fliegen zu klettern, als negative Geotaxis oder Kletter Assay bekannt. Benzer 7 vorgeschlagen 1967, dass der Gegenstrom-Vorrichtung für die Untersuchung der Phototaxis verwendet könnte auch zur Gravitaxis untersuchen. Seitdem haben Ganetzki 8 und viele andere 9 -12 auf der ersten Test gebaut. Das Prinzip ist, um eine bekannte Anzahl der Fliegen in einem Fläschchen zu stellen und tippen Sie auf die Fläschchen kräftig gegen eine harte Oberfläche, wodurch die Fliegen an den Boden des Fläschchens fällt. Da es ein angeborenes Verhalten, werden die Fliegen versuchen, auf der Oberseite des Fläschchens, der Schwerkraft entgegengesetzt zu klettern. Dieser Test ist quantitativ und measures, wie viele Fliegen haben während einer vorgegebenen Zeit an einer Markierung auf dem Fläschchen kletterte. Messung der Geschwindigkeit anstatt der gesamten Anzahl der Fliegen Steigen zu einem verlässlichen Parameter und in Fällen, wo die Anzahl der Fliegen Kriterien nicht signifikant war 13 gezeigt Defekten.
Die Steig Assay in der Studie von vielen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit 14 bewährt. Allerdings haben wir festgestellt, dass Lok Mängel möglicherweise nicht nachweisbar sein zum Zeitpunkt, wo Neurodegeneration ist bereits in pathologischen Studien 14 zu sehen. Somit kann die Verwendung des herkömmlichen Assay die Fähigkeit, die frühen Stadien der Krankheit zu untersuchen Pathogenese begrenzen. Das Aussehen der Lokomotive Defekte während späteren Phasen der Pathologie kann eine Krankheit, deren Progression zu fortgeschritten für komplette Rettungs reflektieren.
Dies wirft ein mögliches Problem mit der Empfindlichkeit des traditionellen Kletter Assay. Der potenzielle Unfähigkeit des tradinalen Klettern Assay zu mild Lokomotive Mängel erkennen kann, um die Höhe, auf die die Fliegen sind erforderlich, um zu klettern zurückzuführen. Die herkömmlichen Assay 15,16 misst die Anzahl der Fliegen, um erfolgreich über eine Höhe von 2 bis 5 cm steigen in 10 bis 20 Sekunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila hat bereits bewiesen, dass ein ausgezeichnetes Modell der Parkinson-Krankheit 14 und andere neurodegenerative Erkrankungen 1,2 sein. Zusätzlich zu den genetischen Werkzeugen von Drosophila, wird dessen Genom sehr für Gene in neurologischen Erkrankungen beteiligten 19 konserviert. Das Aufkommen der genomweite genetische Screening-Methoden (einschließlich ganze Exoms Sequenzierung) wird sich wahrscheinlich fortsetzen, um eine größere Liste der Kandidatenge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Materials
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |
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