의 산화 스트레스 저항을 측정<em> 예쁜 꼬마 선충</em> 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에
Summary
C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.
Abstract
생산 및 반응성 산소 종의 해독 사이의 불균형의 결과이다 산화 스트레스는 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 당뇨, 노화, 암, 인간을 포함한 만성 질환의 주요 원인이다. 따라서, 세포 시스템에서뿐만 아니라 전체 유기체를 사용뿐만 아니라 산화 스트레스를 연구하는 것이 중요하다. C. 엘레 매우 진화 적으로 보존되어 산화 스트레스 신호 전달 경로의 유전학을 연구하는 매력적인 모델 생물이다.
여기서, 우리는 C.에서 산화 적 스트레스 내성을 측정하기 위해 프로토콜을 제공 액체에 간스. 예컨대 파라쿼트 (PQ) 및 H 2 O 2 등 간단히, ROS는 유도 시약 M9 완충액에 용해하고, 용액을 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 분주한다. 동기화 L4 / 젊은 성인 C. 엘레 동물의 우물에 전송된다 (5-8 동물 / 웰) 및 생존율을 측정매 시간마다 대부분의 웜은 죽을 때까지. 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수있는 산화 스트레스시 동물의 행동에 영향을 줄 수있는 노화, 스트레스 번호판의 낮은 농도를 사용하는 산화 적 스트레스 내성 시험을 수행 할 때. 그러나, 본원에 기재된 분석에서,이 문제는 L4 / 젊은 성인 동물이 사용되기 때문에 발생하기 어렵다. 또한,이 프로토콜은 저렴하고 결과는 유전 스크린의 매력이 기술을 렌더링 일일에서 얻을 수있다. 전반적으로,이 산화 스트레스 관련 인간의 장애의 더 나은 특성화로 번역 될 수있는 산화 스트레스 신호 전달 경로를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
진핵 세포에서 미토콘드리아의 전자 전달계에서 일어나는 산화 적 인산화는 ATP의 형태로 에너지 생산의 주요인이다. 반응성 산소 종 (ROS)은이 프로세스의 자연 부산물이다. 분자 신호로서의 중요한 역할에도 불구하고, 과도한 활성 산소는 DNA 손상, 단백질 카르 보닐, 및 지질 산화 될 수 있습니다. ROS 생산 및 해독 간의 불균형 에너지 고갈, 세포 손상에 이르게 산화 스트레스를 유발하고 세포 사멸을 유발 1,2-. 산화 스트레스는 노화, 암, 당뇨, 심혈관 질환 및 신경 퇴행성 질환 3-9 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 발달에 기여한다.
ROS 세포를 적절한 수준을 유지하고 산화 손상 1,2- 대하여 그들의 구성 성분을 보호하는 효소와 비 효소 적 방어 전략을 진화했다. 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제는 (SOD) 효소는 conve 먼저 행동나중에 카탈라아제 또는 과산화 효소에 의해 물로 변환 H 2 O 2에 RT의 슈퍼 옥사이드. 비 효소 적 방어 전략은 대부분 필수 세포 성분을 보호하는 세포 거대 분자에 비해 활성 산소와 빠르게 반응하는 분자를 포함한다. 활성 산소가 효소를 해독의 보호 역할에도 불구하고, 일부 활성 산소 분자는 항산화 방어 메커니즘을 탈출 및 산화 적 손상을 초래할. 감지, 복구 및 손상된 세포 성분의 저하는 산화 스트레스 1,2시 필수적인 방어 전략이다.
스트레스 저항 특히 산화 스트레스에 관여하는 신호 전달 경로 것은 매우 진화 (10, 11)를 보존하고 있습니다. 생명체의 조건이 부분적으로 만 재생되는 세포 배양 실험, 12, 13은 큰 의미를 가지고 모델 생물에서 산화 스트레스의 연구와는 달리. C. 엘레는 막 다른 쉽고 저렴하게 할 수있는 자유 생활 선충이다한천 매체에 세균 잔디밭에 냈다는. 그것은 크기가 작고 일반적으로 (약 1 길이 ㎜) 및 유전자 조작을 용이하게하는 자기 시비 자웅 동체로 성장한다. 그것은 빠른 라이프 사이클과 높은 생식 능력, 세대 당 약 300 자손을 생산하고 그것을 대규모 유전 스크린 (14)을 수행 할 수있는 강력한 도구를하고있다. C. elegans의 게놈 염기 서열을 완전히하고 유전자 40-50 %가 인간의 질병 관련 유전자 15 ~ 18의 동체가 될 것으로 예상된다. 의 RNAi를 사용하여 관심의 유전자의 최저 신속하고 C에서 쉽게 엘레. 유전자 다운 조절은 E. 동물을 공급함으로써 달성 될 수있다 관심 19의 mRNA를 표적의 이중 가닥 RNA를 발현하는 플라스미드를 대장균 박테리아 항구. 따라서, 대규모의 RNAi 스크린을 이용한 유전자 기능의 결정은 암 (20, 21)을 포함하여 인간의 질병을 이해하는데 큰 영향을 미친다.
O의 연구C에서 xidative 스트레스 저항 엘레은 산화 스트레스 13,22에 대한 저항의 보존 메커니즘의 식별을 주도했다. 확인 된 일부 경로는 저산소증, 열, 삼투압 스트레스 같은 다른 스트레스뿐만 아니라 이러한 장수와 저항을 조절하는 일반적인 경로이다. 이 경로는 인슐린 신호, TOR 신호, 그리고 자식 작용을 포함한다. 다른 주요 경로는, 또는 손상의 수리 등의 열 충격 및 보호자 단백질 11,13,22 같은 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 효소와 카탈라아제 효소로 활성 산소의 해독을 포함한다.
이 프로토콜은 C의 산화 적 스트레스에 대한 저항을 확인하는 방법에 대해 설명합니다 액체에 간스. 우리는 이전에 C. 손실시 flcn -1- (ok975)를 산화 적 스트레스에 대한 증가 된 내성을 보여 주었다 때문에 우리는 프로토콜을 설명하기 flcn -1- (ok975) 및 야생형 동물을 사용 엘레 (23). 우리는 또한이 증가 저항이 달려 있음을 보여 주었다AMPK와 자식 작용, 세포 생체 에너지를 향상시키고 응력 저항 (23)을 촉진 시그널링 축. PQ는 반응성 산소 종 (24)를 생성하기 위해 전자 전달계를 방해 산화성 스트레스이다. 같은 분석은 적용 할 수 있고, 다른 ROS 소스 또는 활성 산소 생성 화합물은 H 2 O 2와 로테 논 등 사용할 수 있습니다. 유사한 분석은 PQ의 낮은 농도 (25, 26)를 사용하는 플레이트에 개발되어왔다. 이 분석의 장점은 매우 빠르고, 그 결과는 하루에 획득 될 수 있다는 것이다. 또한, 96 웰 플레이트에서 산화 적 스트레스 저항성 검정을 수행하는 데 사용되는 액체의 총량은 PQ – 함유 플레이트를 제조하는 데 사용되는 체적에 비해 낮다. 따라서, 사용 된 PQ의 양이 분석에서 액체 인 것은 저가 분석을 렌더링하고 유해 폐기물의 생성을 제한하는 낮다. 그러나, 플레이트 분석에 비해이 분석의 한계 라 포함액체 분석에서 음식과 액체 산소의 낮은 농도의 CK는 공기에 비해. 이러한 경우에, 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 따라서,이 분석에서 얻어진 결과를 지원하기 위해 권장 산화 스트레스 저항성 다른 방법을 사용하여 재현성을 확인하기.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. 엘레 쉽게 배양 될 수 있으므로 생체 내에서 유 전적으로 산화 스트레스 내성을 연구하는 매력적인 모델 생물이며, 급속 전적으로 동일한 자손 다수의 리드. 산화 스트레스 저항을 측정하기 위해 여러 방법이 앞서 설명되어 있으며 그러한 PQ, 로테 논, H 2 O 2, 및 juglone 25,26,29-32 ROS 같은 다양한 소스와 배양 접시의 보충에 기초한다. 여기에서 우리는 100 mM의 PQ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 C의 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터를 인정 엘레 균주. 자금 지원은 테리 폭스 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 또한 Rolande과 마르셀 Gosselin의 대학원 재학 및 맥길 통합 암 연구 교육 프로그램의 암 연구 FRN53888에서 CIHR / FRSQ 훈련 보조금에서 EP에 부여 된 지원을 인정합니다.
Materials
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60x15mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library | ||
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