We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
Fluorescens-medieret tomografi (FMT) muliggør langsgående og kvantitativ bestemmelse af fluorescens fordeling in vivo og kan anvendes til at vurdere biofordelingen af hidtil ukendte prober og vurdere sygdomsprogression under anvendelse af etablerede molekylære prober eller reportergener. Kombinationen med en anatomisk modalitet, fx mikro computertomografi (μCT), er til gavn for billedanalyse og til fluorescens genopbygning. Vi beskriver en protokol for multimodal μCT-FMT billedbehandling, herunder billedbehandling nødvendige skridt til at udtrække kvantitative målinger. Efter udarbejdelsen musene og udføre billedbehandling er de multimodale datasæt registreret. Efterfølgende en forbedret fluorescens rekonstruktion udført, som tager hensyn til formen på musen. For kvantitativ analyse, er orgel segmentations genereres på grundlag af de anatomiske data ved hjælp af vores interaktive segmentering værktøj. Endelig biodistributionen curves genereres under anvendelse af en batch-behandling funktion. Vi viser anvendeligheden af metoden ved at vurdere biofordelingen af en velkendt probe som binder til knogler og led.
Fluorescens-medieret tomografi, også kaldet fluorescens molekylære tomografi (FMT), er en lovende teknik til kvantitativ vurdering fluorescensen fordeling i diffuse væv, såsom bedøvede mus eller endog humane kropsvæv, fx bryster eller fingerled. I modsætning til ikke-invasive mikroskopi teknikker, der tillader billeddannelse af overfladiske mål på subcellulær opløsning 1, FMT giver tredimensionel rekonstruktion af fluorescerende kilder i dybder på flere centimeter, om end på lavere opløsning 2. Mange målrettede fluorescerende prober er tilgængelige for billedet angiogenese, apoptose, inflammation og andre 2 – 5,. Nogle prober er aktiverbare, f.eks. Ved specifikke enzym spaltning fører til unquenching af fluorochromer. Desuden kan reportergener udtrykker fluorescerende proteiner skal afbildes, fx til at spore tumorcellemigration 6.
FMT stærkt nyder godt af kombinationen med en anatomisk modalitet, f.eks μCT 2,7 eller MR 8. Mens enkeltstående FMT-enheder er kommercielt tilgængelige 9, er vanskelige at fortolke uden anatomiske referenceoplysninger fluorescens billeder. For nylig var vi i stand til at vise, at de fusionerede anatomiske billeddata muliggør en mere robust analyse 10. De anatomiske data kan også anvendes til at tilvejebringe forudgående viden, såsom den ydre form af mus, hvilket er vigtigt for præcis optisk modellering og fluorescens genopbygning 11. Desuden kan estimeres optiske spredning og absorption maps hjælp segmentering af vævstyper og ved at tildele klasse specifikke koefficienter 12,13. For nær-infrarødt lys, hæmoglobin er den vigtigste absorber i mus, foruden melanin og pels 14. Siden blodvolumen relative varierer regionalt ved størrelsesordener, en absorption map er særlig vigtig for quantitative fluorescens genopbygning 13.
Én fordel ved anvendelse af ikke-invasive billeddannende indretninger er, at musene kan afbildes i længderetningen, dvs., på forskellige tidspunkter. Det er vigtigt at vurdere den dynamiske opførsel af sonder, dvs deres mål ophobning, biodistribution og udskillelse 10,15, eller at vurdere sygdomsprogression 16. Når billeddannelse flere mus på flere tidspunkter, en stor mængde af billedet datasæt opstår. For at aktivere sammenlignelighed, bør disse erhverves på en systematisk måde, dvs. med en veldefineret og dokumenteret protokol. Det store antal scanninger er en udfordring for billedanalyse, som kræves for at udtrække kvantitative målinger fra billeddataene.
Formålet med vores undersøgelse er at give en detaljeret beskrivelse af en μCT-FMT imaging-protokol, som vi anvendte og optimeret hele flere undersøgelser 10,13,15,17,18. Vi beskriverhvordan datasæt genereres, behandles, visualiseres og analyseres. Dette demonstreres ved hjælp af en etableret molekylær probe, OsteoSense, som binder til hydroxyapatit 19, og kan anvendes til at afbilde knoglesygdomme og remodellering 2. Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af den statslige bedømmelsesudvalg på dyrs pleje.
Vi beskriver og anvende en protokol for multimodal μCT-FMT billeddannelse. Vi bruger kommercielt tilgængelige og udbredte FMT og μCT enheder 3,11,15 – 17,21. Mens protokollen kræver en specifik FMT kan μCT erstattes af et andet μCT med lignende funktionalitet og sammenlignelige scanningsparametre fx skal synsfeltet være store nok til at dække musen sengen herunder markører.
FMT er blevet anvendt til biodistribution analyse uden at kombinere det med μCT eller MR 21 imidlertid den anatomiske data er gavnligt at forøge reproducerbarheden fordi segmenteringen kan baseres på organet grænser, der er synlige i de μCT data 10. Mens er blevet udviklet integrerede μCT-FMT enheder 2,7, er disse ikke kommercielt tilgængelige endnu. Desuden er brugen af to separate enheder tillader rør, dvs.., Den næste muse CAn afbildes i μCT mens den første mus er stadig i FMT, for at øge gennemløbet.
For at reducere den manuelle arbejdsbyrde, vi udfører automatisk markør afsløring og fusion. Endvidere er musen formen automatisk segmenteret og denne information forbedrer fluorescensen genopbygning 11,13,22. For kvantitativ fluorescens genopbygning, er absorption og spredning maps behov 13,23. Vi udlede spredning kortet ved automatiseret segmentering af μCT data og tildele kendte scattering koefficienter af flere vævstyper (lunge, knogler, hud, fedt, og den resterende blødt væv) 24. Efterfølgende vi rekonstruere en absorption kort fra det optiske rå data, som er særligt vigtigt for well-perfunderede organer såsom hjertet og leveren 13,20.
Scanning flere mus på forskellige tidspunkter hurtigt resulterer i et stort antal datasæt, der skal analyseres. For biodisbidragsbaserede studier, skal være segmenteret for hver μCT-FMT scanning flere organer. Desværre kan de segmentations ikke genbruges, fordi musen nyligt er placeret i musen seng gentagne gange. Vi bruger et værktøj til interaktiv segmentering, udviklet på vores institut, men andre værktøjer kan også være hensigtsmæssigt 25. Vi genererer voxel-wise segmenteringer, fordi disse matcher bedre til komplekse organer end enkle former såsom ellipser og terninger 26. Automatiseret segmentering hel-dyr ville være nyttigt at yderligere at reducere den manuelle arbejdsbyrde 27, men en interaktiv segmentering værktøj vil stadig være behov for at korrigere for segmentering fejl. Desuden kan automatiserede segmentering værktøjer næppe forudse særlige sager som patologier korrekt. Da vi bruger native μCT scanninger, er meget vanskelige at segment nogle organer såsom milten selv manuelt. Kontrastmidler ville hjælpe, men der er problemer med tolerabilitet og det er vanskeligt at maintaina steady kontrastmiddel fordeling over hele den langsgående billeddannelse.
Vores fantom undersøgelse viser, at signalet lokalisering forbedres ved brug forminformationen til fluorescens genopbygning. In vivo, en tilsvarende forbedring er indlysende for den tidlige tidspunkt (15 min efter injektion), når en stor mængde af proben er allerede i blære. Hydroxyapatit-bindende probe akkumulerer på knogler og led. Det er bemærkelsesværdigt, hvor hurtigt dette sker, dvs. signalet er allerede tydeligt på ryggen 15 min efter injektion. Dette sandsynligvis skyldes den lave molekylvægt af sonden, som muliggør hurtig ekstravasation og diffusion til målregionerne. Proben binder kovalent til sit mål hydroxyapatit og den ubundne probe udskilles. For de senere tidspunkter, mellem 6 timer og 24 timer efter injektion, signalintensiteten i rygsøjlen forbliver relativt stabil, sandsynligvis, fordi næppe lys rebrokken dybt ind i musen til at blege fluorescensen. For vores undersøgelse, brugte vi 750 nm kanal, hvilket resulterer i lav baggrund fluorescens som tydeligt for scanninger erhvervet før injektion. Ved lavere bølgelængder, kan mere baggrund signal forventes 28.
Sammenfattende beskriver vi en multimodal billedbehandling protokol for kommercielt tilgængelige FMT og μCT enheder. Vi viser, at kombinationen giver fordele for fluorescens genopbygning. Vi viser, hvordan biofordelingen kurver er udvundet fra den store mængde billeddata ved hjælp af segmentering interaktiv orgel og batchbehandling. Vi mener, at denne standardiserede arbejdsgang kan være nyttigt for lægemiddeludvikling og andre billeddiagnostiske undersøgelser ved hjælp af fluorescens-mærkede prober.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Marek Weiler til udførelse af phantom eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), den tyske stat Nordrhein-Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE) ForSaTum), den tyske Ministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF) (finansieringsprogrammer Virtual Lever (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), Den RWTH Aachen University (I 3 TM Seed Fund), og Philips Research (Aachen, Tyskland).
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |