We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
प्रतिदीप्ति की मध्यस्थता टोमोग्राफी (FMT) vivo में प्रतिदीप्ति वितरण के अनुदैर्ध्य और मात्रात्मक दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है और उपन्यास जांच के biodistribution के आकलन करने के लिए और स्थापित आणविक जांच या रिपोर्टर जीन का उपयोग कर रोग प्रगति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए एक संरचनात्मक साधन, के साथ संयोजन, सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (μCT), छवि विश्लेषण के लिए और प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण के लिए फायदेमंद है। हम मात्रात्मक मापन निकालने के लिए आवश्यक छवि प्रसंस्करण कदम सहित बहुविध μCT-FMT इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। चूहों की तैयारी और इमेजिंग प्रदर्शन के बाद, बहुविध डेटा सेट पंजीकृत हैं। बाद में, एक बेहतर प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण खाते में माउस के आकार लेता है, जो प्रदर्शन किया है। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, अंग segmentations हमारे इंटरेक्टिव विभाजन उपकरण का उपयोग संरचनात्मक डेटा के आधार पर उत्पन्न कर रहे हैं। अंत में, biodistribution के घनrves एक बैच प्रसंस्करण सुविधा का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। हम हड्डियों और जोड़ों को बांधता है कि एक जाने-माने जांच के biodistribution के आकलन करके पद्धति के प्रयोग को दिखाते हैं।
प्रतिदीप्ति की मध्यस्थता टोमोग्राफी, यह भी कहा जाता प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी (FMT), मात्रात्मक इस तरह से anesthetized चूहों या यहां तक कि मानव शरीर के ऊतकों, जैसे, स्तन या उंगली जोड़ों के रूप में फैलाना ऊतकों में प्रतिदीप्ति वितरण का आकलन करने के लिए एक आशाजनक तकनीक है। Subcellular संकल्प 1 पर सतही लक्ष्यों की इमेजिंग की अनुमति है, जो गैर इनवेसिव माइक्रोस्कोपी तकनीक, के विपरीत, FMT कम संकल्प 2 पर यद्यपि कई सेंटीमीटर की गहराई में फ्लोरोसेंट सूत्रों के तीन आयामी पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। 5 – कई लक्षित फ्लोरोसेंट जांच छवि एंजियोजिनेसिस, एपोप्टोसिस, सूजन, और 2 अन्य के लिए उपलब्ध हैं। कुछ जांच, सक्रिय हैं जैसे।, Fluorochromes की unquenching के लिए अग्रणी विशेष एंजाइम दरार से। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त रिपोर्टर जीन ट्यूमर सेल प्रवास 6 ट्रैक करने के लिए, उदाहरण के लिए, imaged किया जा सकता है।
FMT जोरदार जैसे, 2,7 या एमआरआई 8 μCT, एक संरचनात्मक साधन के साथ संयोजन से लाभ। स्टैंड-अलोन FMT उपकरणों के व्यावसायिक रूप से 9 उपलब्ध हैं, प्रतिदीप्ति छवियों संरचनात्मक संदर्भ जानकारी के बिना व्याख्या करना मुश्किल है। हाल ही में हमने इनकार शारीरिक छवि डेटा एक और अधिक मजबूत विश्लेषण 10 में सक्षम बनाता है, यह दिखाने के लिए सक्षम थे। संरचनात्मक डेटा भी इस तरह के सटीक ऑप्टिकल मॉडलिंग और प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण 11 के लिए महत्वपूर्ण है जो माउस, की बाहरी आकार के रूप में पूर्व ज्ञान प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑप्टिकल बिखरने और अवशोषण नक्शे प्रकार के ऊतकों के विभाजन का उपयोग करने का अनुमान है और वर्ग विशेष गुणांक 12,13 बताए द्वारा किया जा सकता है। लगभग अवरक्त प्रकाश के लिए, हीमोग्लोबिन मेलेनिन और फर के 14 के अलावा चूहों में मुख्य अवशोषक है। रिश्तेदार रक्त की मात्रा परिमाण के आदेश से क्षेत्रीय रूप से भिन्न होता है के बाद से, एक अवशोषण नक्शा क्वान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैtitative प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण 13।
गैर इनवेसिव इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करने का एक लाभ यह चूहों कई समय बिंदुओं पर, यानी, अनुलंबीय imaged किया जा सकता है। इस जांच के गतिशील व्यवहार, यानी, अपने लक्ष्य संचय, biodistribution और उत्सर्जन 10,15 आकलन करने के लिए, या रोग प्रगति 16 का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। कई बार बिंदुओं पर कई चूहों जब इमेजिंग, छवि डेटा सेट की एक बड़ी राशि उठता है। तुलनीयता सक्षम करने के लिए ये एक अच्छी तरह से परिभाषित और दस्तावेज प्रोटोकॉल के साथ, एक व्यवस्थित तरीके से, यानी में अधिग्रहण किया जाना चाहिए। स्कैन के बड़ी संख्या में छवि डेटा से मात्रात्मक मापन निकालने के लिए आवश्यक है, जो छवि विश्लेषण के लिए एक चुनौती बन गया है।
हमारे अध्ययन का उद्देश्य कई अध्ययनों 10,13,15,17,18 के दौरान हम इस्तेमाल किया और अनुकूलित जो एक μCT-FMT इमेजिंग प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान करना है। हम वर्णनडेटा सेट उत्पन्न कर रहे हैं, कैसे, प्रसंस्कृत कल्पना की है, और विश्लेषण किया गया। इस 19 हाइड्रॉक्सियापटाइट को बांधता है कि एक स्थापित आणविक जांच, OsteoSense, का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया है, और छवि हड्डी रोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और 2 remodeling। जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं जानवरों की देखभाल पर सरकारी समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
हम वर्णन और बहुविध μCT-FMT इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल लागू होते हैं। 17,21 – हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और व्यापक रूप से इस्तेमाल FMT और μCT उपकरणों 3,11,15 का उपयोग करें। प्रोटोकॉल एक विशिष्ट FMT की आवश्यकता है, μCT जैसे इसी तरह की कार्यक्षमता और तुलनीय स्कैनिंग मापदंडों के साथ एक और μCT द्वारा बदला जा सकता है, देखने के क्षेत्र मार्करों सहित माउस बिस्तर कवर करने के लिए इतना बड़ा होना चाहिए।
FMT μCT या एमआरआई 21 के साथ संयोजन के बिना biodistribution के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है, हालांकि, संरचनात्मक डेटा विभाजन μCT डेटा 10 में दिखाई दे रहे हैं, जो अंग सीमाओं के आधार पर किया जा सकता है क्योंकि reproducibility बढ़ाने के लिए फायदेमंद है। एकीकृत μCT-FMT उपकरणों 2,7 विकसित किया गया है, ये अभी तक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, दो अलग-अलग उपकरणों के उपयोग पाइपिंग, की अनुमति देता है अर्थात।, अगले माउस सीएपहला माउस throughput बढ़ाने के लिए, FMT में अब भी है, जबकि एन μCT में imaged किया।
मैनुअल काम का बोझ कम करने के लिए, हम स्वचालित मार्कर का पता लगाने और फ्यूजन प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, माउस आकार स्वचालित रूप से खंडित है और इस जानकारी को काफी प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण 11,13,22 में सुधार। मात्रात्मक प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण के लिए, अवशोषण और बिखरने नक्शे 13,23 जरूरत है। हम μCT डेटा के स्वचालित विभाजन और कई प्रकार के ऊतकों के नाम से जाना जाता बिखरने गुणांक बताए (फेफड़े, हड्डी, त्वचा, वसा, और शेष नरम ऊतक) 24 से बिखरने नक्शा निकाले जाते हैं। इसके बाद, हम इस तरह के दिल और जिगर 13,20 के रूप में अच्छी तरह से perfused अंगों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो ऑप्टिकल कच्चे डेटा से एक अवशोषण नक्शा पुनर्निर्माण किया।
कई बार बिंदुओं पर कई चूहों स्कैन जल्दी से डेटा की एक बड़ी संख्या में परिणामों का विश्लेषण किया जा करने के लिए सेट करता है। Biodis के लिएयोगदान के अध्ययन, कई अंगों प्रत्येक μCT-FMT स्कैन के लिए खंडित किए जाने की जरूरत है। माउस नव बार बार माउस बिस्तर में तैनात है, क्योंकि दुर्भाग्य से, segmentations, पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता। हम अपने संस्थान में विकसित इंटरैक्टिव विभाजन के लिए एक उपकरण है, का उपयोग करें, हालांकि, अन्य उपकरण भी 25 उपयुक्त हो सकता है। ये ऐसे ellipses और क्यूब्स 26 के रूप में साधारण आकार की तुलना में जटिल अंगों को बेहतर मैच, क्योंकि हम voxel वार segmentations उत्पन्न करते हैं। स्वचालित पूरे पशु विभाजन आगे मैनुअल काम का बोझ कम करने के लिए 27 उपयोगी होगा, लेकिन एक इंटरैक्टिव विभाजन उपकरण अभी भी विभाजन त्रुटियों के लिए सही करने के लिए आवश्यक होगा। इसके अलावा, स्वचालित विभाजन उपकरण ऐसे सही ढंग से विकृतियों के रूप में विशेष मामलों में शायद ही आशा कर सकते हैं। हम देशी μCT स्कैन का उपयोग करते हैं, इस तरह की तिल्ली के रूप में कुछ अंगों को भी मैन्युअल रूप से खंड के लिए बहुत मुश्किल है। इसके विपरीत एजेंटों में मदद मिलेगी, लेकिन सहनशीलता के साथ समस्याओं कर रहे हैं और यह maintai के लिए मुश्किल हैअनुदैर्ध्य इमेजिंग भर ना स्थिर विपरीत एजेंट वितरण।
हमारे प्रेत अध्ययन प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण के लिए आकार के बारे में जानकारी का उपयोग करते समय संकेत स्थानीयकरण सुधार होता है कि पता चलता है। विवो में, एक समान सुधार जल्दी समय बिंदु के लिए जांच की एक बड़ी राशि में पहले से ही है जब (इंजेक्शन के बाद 15 मिनट), स्पष्ट है मूत्राशय। हाइड्रॉक्सियापटाइट बाध्यकारी जांच हड्डियों और जोड़ों में जम जाता है। यह इस यानी, संकेत पहले से ही इंजेक्शन के बाद रीढ़ की हड्डी 15 मिनट पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, तब होता है कि कितनी तेजी से उल्लेखनीय है। यह शायद लक्ष्य क्षेत्रों को तेजी से परिस्त्राव और प्रसार के लिए सक्षम बनाता है जो जांच के कम आणविक भार के कारण होता है। जांच अपने लक्ष्य हाइड्रॉक्सियापटाइट को covalently बांध और अपार जांच उत्सर्जित किया जाता है। बाद में समय बिंदुओं के लिए, 6 घंटे और इंजेक्शन के बाद 24 घंटे के बीच, रीढ़ की हड्डी में संकेत तीव्रता, शायद, अपेक्षाकृत स्थिर बनी हुई है शायद ही कोई प्रकाश पुन क्योंकिप्रतिदीप्ति ब्लीच करने के लिए गहरी माउस में दर्द। हमारे अध्ययन के लिए, हम इंजेक्शन से पहले हासिल कर ली स्कैन के लिए स्पष्ट रूप में कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में जो परिणाम 750 एनएम चैनल का उपयोग किया था। कम तरंग दैर्ध्य में, अधिक पृष्ठभूमि संकेत 28 की उम्मीद की जा सकती है।
सारांश में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FMT और μCT उपकरणों के लिए एक बहुविध इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन। हम संयोजन प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण के लिए लाभ प्रदान करता है कि पता चलता है। हम biodistribution घटता इंटरैक्टिव अंग विभाजन और बैच प्रसंस्करण के माध्यम से छवि डेटा की बड़ी राशि से निकाले जाते हैं वर्णन कैसे। हम इस मानकीकृत कार्यप्रवाह दवा के विकास और fluorescently लेबल जांच का उपयोग अन्य इमेजिंग अध्ययन के लिए सहायक हो सकता है कि विश्वास करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रेत प्रयोगों प्रदर्शन के लिए मारेक Weiler धन्यवाद। इस काम के लिए यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी शुरू अनुदान 309,495: NeoNaNo) द्वारा समर्थित किया गया था, नॉर्थ राइन वेस्टफेलिया के जर्मन संघीय राज्य (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-डेबूटस्ट्रैप (EFRE); ForSaTum), जर्मन शिक्षा और अनुसंधान (BMBF) के लिए मंत्रालय (वित्त पोषण कार्यक्रमों वर्चुअल जिगर (0,315,743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), RWTH आकिन विश्वविद्यालय (मैं 3 टीएम बीज कोष), और फिलिप्स रिसर्च (आकिन, जर्मनी)।
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |