We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
Fluorescens-mediert tomografi (FMT) muliggjør langsgående og kvantitativ bestemmelse av fordelingen fluorescens in vivo, og kan brukes til å vurdere biofordelingen av nye prober og for å vurdere sykdomsutviklingen ved bruk av etablerte molekylære prober eller rapportørgener. Kombinasjonen med en anatomisk modalitet, f.eks, micro computertomografi (μCT), er gunstig for bildeanalyse og for fluorescens gjenoppbygging. Vi beskriver en protokoll for multimodal μCT-FMT bildebehandling inkludert bildebehandlings nødvendige skritt for å trekke kvantitative målinger. Etter utarbeidelse av mus og utfører bildebehandling, er multimodale datasett registrert. Deretter blir en forbedret fluorescens rekonstruksjon utført, noe som tar hensyn til formen på mus. For kvantitativ analyse, er organ segmentations generert basert på de anatomiske data ved hjelp av vårt interaktive segmenteringsverktøy. Til slutt, biofordelingen cukurvene under genereres ved hjelp av en batch-prosessering funksjon. Vi viser anvendelsen av fremgangsmåten ved å vurdere biofordelingen av en velkjent probe som binder seg til ben og ledd.
Fluorescens-mediert tomografi, også kalt fluorescens molekyl tomografi (FMT), er en lovende metode for kvantitativt å vurdere fordelingen fluorescens i diffuse vev, slik som bedøvede mus eller menneskelige kroppsvev, f.eks bryster eller fingerledd. I motsetning til ikke-invasive mikroskopi teknikker, som tillater avbildning av overfladiske mål på subcellulære oppløsning 1 lar FMT tredimensjonal rekonstruksjon av fluorescerende kilder i dypet av flere centimeter, men med lavere oppløsning 2. Mange målrettet fluorescerende prober er tilgjengelig for bilde angiogenese, apoptose, inflammasjon og andre 2-5. Noen prober er aktiverbart, f.eks., Ved spesifikk enzymspaltningssete fører til unquenching av fluorokromer. Videre kan reporter gener uttrykker fluorescerende proteiner avbildes, for eksempel for å spore svulst celle migrasjon 6.
FMT sterkt drar nytte av kombinasjonen med en anatomisk modalitet, f.eks μCT 2,7 eller MR 8. Mens frittstående FMT enheter er kommersielt tilgjengelige 9, fluorescens bildene er vanskelige å tolke uten anatomisk referanseinformasjon. Nylig var vi i stand til å vise at de fusjonerte anatomiske bildedata muliggjør en mer robust analyse 10. De anatomiske data kan også benyttes til å tilveiebringe tidligere kunnskap, slik som den ytre form av musen, som er viktig for nøyaktig modellering og fluorescens optisk rekonstruksjon 11. Videre kan optiske spredning og absorpsjon kartene beregnes ved hjelp av segmentering av vevstyper og ved å tildele klassespesifikke koeffisienter 12,13. For nær-infrarødt lys, er hemoglobin hoveddemperen i mus, i tillegg til melanin og pels 14. Siden den relative blodvolum varierer regionalt av størrelsesordener, er spesielt viktig for Quan An absorpsjon karttitative fluorescens gjenoppbygging 13.
En fordel ved å bruke ikke-invasive bildeapparater er at musene kan avbildes i lengderetningen, dvs. ved flere tidspunkter. Det er viktig å vurdere den dynamiske oppførsel av sonder, dvs. deres mål akkumulering, biodistribusjon og utskillelse 10,15, eller for å vurdere sykdomsprogresjon 16. Når bildebehandling flere mus på flere tidspunkter, oppstår det en stor mengde bilde datasett. For å aktivere sammenlignbarhet, bør disse være kjøpt på en systematisk måte, dvs. med en godt definert og dokumentert protokollen. Det store antallet skanninger er en utfordring for bildeanalyse, som er nødvendig for å trekke kvantitative målinger fra bildedataene.
Hensikten med vår studie er å gi en detaljert beskrivelse av en μCT-FMT bildebehandling protokollen som vi brukte og optimalisert gjennom flere studier 10,13,15,17,18. Vi beskriverhvor datasettene blir generert, behandlet, visualisert og analysert. Dette er demonstrert ved anvendelse av en etablert molekylær probe, OsteoSense, som binder seg til hydroksyapatitt 19, og kan brukes til å avbilde bensykdommer og ombygging 2. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av den offentlige granskningskomité på dyr omsorg.
Vi beskriver og bruke en protokoll for multimodal μCT-FMT bildebehandling. Vi bruker kommersielt tilgjengelig og mye brukt FMT og μCT enheter 3,11,15 – 17,21. Mens protokollen krever en bestemt FMT kan μCT erstattes av en annen μCT med lignende funksjoner og sammenlignbare parametere for skanning, for eksempel bør det synsfeltet være stor nok til å dekke mus seng inkludert markørene.
Den FMT har vært brukt for biodistribusjon analyse uten å kombinere det med μCT eller MR 21, er imidlertid den anatomiske data gunstig å øke reproduserbarheten fordi segmenteringen kan være basert på organgrenser som er synlige i det μCT data 10. Mens integrerte μCT-FMT enheter har blitt utviklet 2,7, disse er ikke kommersielt tilgjengelig ennå. Videre tillater bruken av to separate enheter rør, det vil si., Den neste mus CAN avbildes i μCT mens den første mus er fortsatt i FMT, for å øke gjennomstrømningen.
For å redusere den manuelle arbeidsmengden, vi utfører automatisert markør deteksjon og fusion. Videre er formen mus automatisk segmentert og denne informasjonen forbedrer fluorescensen oppbyggingen 11,13,22. For kvantitativ fluorescens gjenoppbygging, er absorpsjon og spredning kart trengte 13,23. Vi utlede spredning kartet ved automatisert segmentering av μCT data og tildele kjente spredning koeffisientene flere vevstyper (lunge, bein, hud, fett, og resterende bløtvev) 24. Deretter vi rekonstruere en absorpsjon kart fra det optiske rådata som er spesielt viktig for riktig-perfuserte organer, slik som hjertet og leveren 13,20.
Skanning flere mus på flere tidspunkter raskt resulterer i et stort antall datasett som skal analyseres. For BIODISsjonsstudier, flere organer må segmenteres for hver μCT-FMT scan. Dessverre kan de segmentations ikke gjenbrukes, fordi musa er nylig plassert i musen sengen gjentatte ganger. Vi bruker et verktøy for interaktiv segmentering, utviklet ved vårt institutt, men andre verktøy kan også være aktuelt 25. Vi skaper vokselver-messig segmentations, fordi disse passer bedre til komplekse organer enn enkle former som ellipser og kuber 26. Automatisert hel-animalsk segmentering ville være nyttig for ytterligere å redusere den manuelle arbeidsbelastning 27, men et interaktivt segmenterings verktøyet ville fortsatt være nødvendig å korrigere for segmenteringsfeil. Videre kan automatiserte segmenteringsverktøy knapt forutse spesielle tilfeller, for eksempel patologier korrekt. Siden vi bruker innfødte μCT skanninger, noen organer som milt er svært vanskelig å segmentere selv manuelt. Kontrastmidler ville hjelpe, men det er problemer med toleranse, og det er vanskelig å maintaina jevn kontrastmiddel distribusjon i hele lengde bildebehandling.
Vår fantom studie viser at signalet lokalisering er forbedret ved bruk av formen informasjonen for rekonstruksjon fluorescens. In vivo, er en tilsvarende forbedring åpenbart for tidlig tidspunkt (15 minutter etter injeksjon), når en stor mengde av sonden er allerede i urinblære. Den hydroksyapatitt-bindende probe akkumuleres på ben og ledd. Det er bemerkelsesverdig hvor raskt dette skjer, det vil si, er signalet allerede er godt synlig på ryggraden 15 min etter injeksjon. Dette er sannsynligvis forårsaket av den lave molekylvekt av sonden, noe som muliggjør hurtig ekstravasasjon og diffusjon til målregioner. Sonden binder kovalent til sitt mål hydroksyapatitt og det ubundne probe utskilles. For de senere tidspunkter, mellom 6 timer og 24 timer etter injeksjon, signalintensiteten i ryggraden er relativt stabil, antagelig fordi nesten ingen lys resmerter dypt inn i musen til å bleike fluorescens. For vår studie har vi brukt 750 nm kanal, noe som resulterer i lav bakgrunnsfluorescensen så tydelig for de skanner ervervet før injeksjon. Ved lavere bølgelengder, kan mer bakgrunnssignal forventes 28.
I sammendraget beskriver vi en multimodal bildebehandling protokoll for kommersielt tilgjengelige FMT og μCT enheter. Vi viser at kombinasjonen gir fordeler for fluorescens gjenoppbygging. Vi illustrere hvordan biofordelingsstudier kurvene ekstraheres fra den store mengden av bildedata ved hjelp av interaktiv organ segmentering og satsvis behandling. Vi tror at dette standardisert arbeidsflyt kan være nyttig for legemiddelutvikling og andre bildebehandlings studier med fluorescensmerkede prober.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Marek Weiler for å utføre fantom eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av European Research Council (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), den tyske delstaten Nordrhein Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Prog (EFRE); ForSaTum), den tyske Departementet for utdanning og forskning (BMBF) (finansiering programmer Virtual Liver (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), RWTH Aachen universitetet (jeg tre TM Seed Fund), og Philips Research (Aachen, Tyskland).
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |