We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
Fluorescens-medierad tomografi (FMT) möjliggör longitudinell och kvantitativ bestämning av fluorescens fördelning in vivo och kan användas för att bedöma biodistributionen av nya prober och bedöma sjukdomsförloppet med hjälp av etablerade molekylära prober eller reportergener. Kombinationen med en anatomisk modalitet, t.ex. mikro datortomografi (μCT), är fördelaktigt för bildanalys och för fluorescens återuppbyggnad. Vi beskriver ett protokoll för multimodal μCT-FMT avbildning inklusive bildbehandlings nödvändiga åtgärder för att utvinna kvantitativa mätningar. Efter beredning mössen och utföra bildbehandling, de multimodala datamängder registreras. Därefter är en förbättrad fluorescens rekonstruktion utförs, som tar hänsyn till formen på musen. För kvantitativ analys är segmenteorgan genereras baserat på de anatomiska data med hjälp av vår interaktiva segmente verktyg. Slutligen biodistributionen curves genereras med användning av en gruppbearbetning funktionen. Vi visar tillämpningen av förfarandet genom att bedöma biofördelningen av ett välkänt sond som binder till ben och leder.
Fluorescens-medierad tomografi, även kallad fluorescens molekylär tomografi (FMT), är en lovande teknik för att kvantitativt bedöma fluorescens distribution i diffusa vävnader, såsom sövda möss eller ens mänskliga kroppsvävnader, t.ex. bröst och fingerleder. I motsats till icke-invasiva mikroskopi tekniker, som möjliggör avbildning av ytliga mål på subcellulär upplösning 1 tillåter FMT tredimensionell rekonstruktion av fluorescerande källor i djupet av några centimeter, om än i lägre upplösning 2. Många riktade fluorescerande prober finns bilden angiogenes, apoptos, inflammation, och andra 2-5. Vissa sonder är aktiveras, exempelvis genom särskilda enzymklyvning leder till unquenching av fluorokromer.,. Dessutom kan reportergener som uttrycker fluorescerande proteiner avbildas, t.ex. för att spåra tumörcellmigrering 6.
FMT gynnar starkt från kombinationen med en anatomisk modalitet, t.ex. μCT 2,7 eller MRI 8. Medan fristående FMT anordningar är kommersiellt tillgängliga 9, fluorescens bilder är svåra att tolka utan anatomisk referensinformation. Nyligen kunde vi visa att den smält anatomiska bilddata möjliggör en mer robust analys 10. De anatomiska data kan också användas för att ge förkunskaper, såsom den yttre formen av musen, som är viktiga för en korrekt optisk modellering och fluorescens återuppbyggnad 11. Dessutom kan optiska spridningen och absorptionen kartor uppskattas med hjälp segmentering av vävnadstyper och genom att tilldela klass specifika koefficienter 12,13. För nära infrarött ljus, är hemoglobin huvud absorbatorn i möss, förutom melanin och päls 14. Eftersom den relativa volymen blod varierar regionalt med tiopotenser, är särskilt viktigt för Quan An absorption kartatitativ fluorescens rekonstruktion 13.
En fördel med användning av icke-invasiva avbildningsanordningar är att mössen kan avbildas i längdled, dvs vid multipla tidpunkter. Detta är viktigt för att bedöma det dynamiska beteendet hos prober, dvs deras mål ackumulation, biodistribution och utsöndring 10,15, eller att bedöma sjukdomsförloppet 16. När avbildning flera möss vid flera tidpunkter, en stor mängd bilddatamängder uppstår. För att möjliggöra jämförbarhet, bör dessa förvärvas på ett systematiskt sätt, det vill säga med en väl definierad och dokumenterad protokoll. Det stora antalet avsökningar innebär en utmaning för bildanalys, som krävs för att extrahera kvantitativa mätningar från nämnda bilddata.
Syftet med vår studie är att ge en detaljerad beskrivning av en μCT-FMT avbildning protokoll som vi använt och optimeras genom flera studier 10,13,15,17,18. Vi beskriverhur datamängder genereras, behandlas, visualiseras och analyseras. Detta visas med användning av ett etablerat molekylsond, OsteoSense, som binder till hydroxiapatit 19, och kan användas för att avbilda skelettsjukdomar och remodeling 2. Alla som deltar i djurförsök har godkänts av den statliga granskningskommitté på djurvård.
Vi beskriva och tillämpa ett protokoll för multimodal μCT-FMT avbildning. Vi använder kommersiellt tillgängliga och används i stor utsträckning FMT och μCT enheter 3,11,15 – 17,21. Medan protokollet kräver en specifik FMT kan μCT ersättas av en annan μCT med liknande funktionalitet och jämförbara inläsningsparametrarna, t.ex. bör synfältet vara tillräckligt stor för att täcka musen sängen inklusive markörer.
FMT har använts för biodistribution analys utan att kombinera det med μCT eller MRI 21 är emellertid den anatomiska data som fördelaktigt att öka reproducerbarheten, eftersom den segmente kan baseras på gränserna organ som är synliga i μCT uppgifter 10. Även integrerade μCT-FMT-enheter har utvecklats 2,7, dessa inte är kommersiellt tillgängliga ännu. Vidare har användningen av två separata anordningar tillåter rörledningar, dvs., Nästa mus can avbildas i μCT medan den första musen är fortfarande i FMT, för att öka genomströmningen.
För att minska den manuella arbetsbördan, vi utför automatiserad markör upptäckt och fusion. Dessutom är musformen automatiskt segmenterade och denna information avsevärt förbättrar fluorescens återuppbyggnad 11,13,22. För kvantitativ fluorescens rekonstruktion, är absorption och spridning kartor behövs 13,23. Vi härleda spridningskartan genom automatiserad segmentering av μCT uppgifter och tilldela kända spridningskoefficienterna flera vävnadstyper (lunga, ben, hud, fett, och återstående mjukdelar) 24. Därefter vi rekonstruera en absorption karta från den optiska rådata som är särskilt viktigt för väl perfusion organ som hjärta och lever 13,20.
Skanna flera möss vid flera tidpunkter snabbt resulterar i ett stort antal uppgifter som skall analyseras. För biodisavgiftsstudier, flera organ måste segmenteras för varje μCT-FMT scan. Olyckligtvis kan de segmenteringar inte återanvändas, eftersom musen är nyligen placerat i musen bädden upprepade gånger. Vi använder ett verktyg för interaktiv segmentering, som utvecklats vid vårt institut, men andra verktyg kan också vara lämpligt 25. Vi skapar voxel-wise segmente, eftersom dessa motsvarar bättre till komplexa organ än enkla former såsom ellipser och kuber 26. Automatiserad hela-djur segmente vore lämpligt att ytterligare minska den manuella arbetsbördan 27, men ett interaktivt segmente verktyg skulle fortfarande krävas för att korrigera för segmente fel. Dessutom kan automatiserade segmente verktyg knappast förutse specialfall såsom patologier korrekt. Eftersom vi använder infödda μCT skannar, vissa organ såsom mjälten är mycket svåra att segmentet även manuellt. Kontrastmedel skulle hjälpa, men det finns problem med tolererbarhet och det är svårt att upprätthålna stadig kontrastmedel distribution i hela den längsgående avbildning.
Vår fantom studie visar att signalen lokalisering förbättras vid användning av informationen formen för fluorescens rekonstruktion. In vivo är en liknande förbättring uppenbar för tidig tidpunkt (15 minuter efter injektion), när en stor mängd av proben redan finns i urinblåsa. Den hydroxyapatit-bindande sond ackumuleras i ben och leder. Det är anmärkningsvärt hur snabbt detta sker, det vill säga, är signalen redan väl synlig på ryggraden 15 minuter efter injektionen. Detta förmodligen orsakas av den låga molekylvikten av sonden, vilket möjliggör snabb extravasation och diffusion till målregionerna. Sonden binder kovalent till sitt mål hydroxyapatit och obunden prob utsöndras. För senare tidpunkter, mellan 6 h och 24 h efter injektion, signalintensiteten i ryggraden är relativt stabil, förmodligen, eftersom knappast något ljus revärk djupt in i musen för att bleka fluorescens. För vår studie har vi använt 750 nm-kanal, vilket resulterar i låg bakgrundsfluorescens som uppenbart för skanningar som förvärvats före injektion. Vid lägre våglängder, kan förväntas mer bakgrundssignal 28.
Sammanfattningsvis beskriver vi en multimodal avbildningsprotokoll för kommersiellt tillgängliga FMT och μCT enheter. Vi visar att kombinationen ger fördelar för fluorescens återuppbyggnad. Vi visar hur biodistributionen kurvorna extraheras från den stora mängden bilddata med hjälp av en interaktiv organsegmentering och batch-bearbetning. Vi tror att detta standardiserade arbetsflöde kan vara till hjälp för läkemedelsutveckling och andra avbildnings studier med fluorescerande prober.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Marek Weiler för att utföra fantom experiment. Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC Starting Grant 309.495: NeoNaNo), den tyska delstaten Nordrhein-Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE), ForSaTum), den tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (finansieringsprogram Virtual Lever (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), i RWTH Aachen (I 3 TM Seed Fund), och Philips Research (Aachen, Tyskland).
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |