To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.
Leveren har en stor evne til at regenerere. Hepatocytter de parenchymale celler i leveren, kan regenerere på en af to måder: hepatocyte- eller biliær-driven leverregenerering. I hepatocyt-drevet lever regenerering er regenererende hepatocytter stammer fra allerede eksisterende hepatocytter, der henviser til, galde-drevet regeneration, er regenererende hepatocytter stammer fra biliære epithelceller (BECs). For hepatocyt-drevet lever regenerering, der er fremragende gnaver modeller, der har bidraget væsentligt til den nuværende forståelse af liver regenerering. Findes ingen sådan gnavermodel men for galde-drevne liver regenerering. Vi har for nylig rapporteret om en zebrafisk leverskade model, hvor BECs udstrakt give anledning til hepatocytter ved alvorlig hepatocyt tab. I denne model er hepatocytter specifikt ablateres af en farmakogenetiske midler. Her præsenterer vi i detaljer metoder til at ablatere hepatocytter og analysere BEC-drevne lever regenereringsproces.Denne hepatocyt-specifikke ablation model kan yderligere bruges til at opdage de underliggende molekylære og cellulære mekanismer galde-drevne liver regenerering. Endvidere kan anvendes disse metoder til kemiske screeninger til identifikation af små molekyler, som styrker eller undertrykker leverregenerering.
Leveren er et meget regenerativ organ. Under leverregenerering, regenererende hepatocytter, de parenchymale celler i leveren, er afledt af allerede eksisterende hepatocytter (hepatocyt-driven leverregenerering) eller BECs (galde-driven leverregenerering) 1,2. Leverskader normalt fremkalder spredning af allerede eksisterende hepatocytter; men når hepatocytproliferation er kompromitteret, kan BECs bidrage til hepatocytter 2-4. Disse to former for leverregenerering er klinisk signifikant. Efter kirurgisk fjernelse af en del af den humane lever (f.eks på grund af levertumorer og levende lever donorer), hepatocytter i leveren resterende prolifererer at genvinde det tabte leveren masse. Derimod hos patienter med alvorlige leversygdomme, hepatocytproliferation er stærkt kompromitteret, så BECs eller lever progenitorceller (LPCs) synes at bidrage til regenererende hepatocytter 5,6. Gnaveren 2/3 partiel hepatektomi model, hvorhepatocytter formere at genvinde den tabte leveren masse, væsentligt har bidraget til den nuværende forståelse af hepatocyt-drevne liver regenerering 7,8. Der er imidlertid ingen gyldig gnaver model, hvor regenererende hepatocytter hovedsageligt afledt af BECs. Selv om flere gnaver lever toksin modeller førte til identifikation af galde-driven leverregenerering 2-4, seneste afstamningsceller opsporing undersøgelser i mus indikerer en minimal bidrag BECs til regenererende hepatocytter i disse modeller 9,10. Nogle af de gnaver leverskade modeller, herunder partiel hepatektomi 11-13 og acetaminophen-induceret leverskade 14,15, er blevet anvendt på zebrafisk og førte til identifikation af hidtil ukendte gener eller veje impliceret i leverregenerering. Imidlertid hepatocyt-drevet, men ikke BEC-drevet, forekommer leverregenerering i disse zebrafisk leverskader modeller. Derfor er en ny leverskade model, hvor BECs udstrakt bidrage til regenerating hepatocytter er nødvendig for en bedre forståelse af BEC-drevne liver regenerering.
De overordnede mål for hepatocyt ablation modellen beskrevet her, er (1) til at generere en leverskade model, hvor BECs udstrakt bidrage til regenererende hepatocytter, og (2) belyse de molekylære og cellulære mekanismer bag BEC-drevet liver regenerering. Vi antager, at alvoren af skaden bestemmer tilstanden af lever regenerering; Således har vi forudså, at galde-driven leverregenerering vil initiere ved alvorlig hepatocyt skade. For at teste denne hypotese, udviklede vi en zebrafisk leverskade model ved at generere en transgen linie, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, at stærkt udtrykker bakteriel nitroreduktase (NTR) fusioneret med cyan fluorescerende protein (CFP) under hepatocyt-specifik fabp10a promotoren. Siden NTR omdanner ikke-toksisk prodrug, metronidazol (Mtz) til et cytotoksisk lægemiddel, det ablaterer kun den planlagte NTR-udtrykkende celler 16-18, i dette tilfælde, hepatocytterne. Ved at manipulere varighed Mtz behandling, kan omfanget af hepatocyt ablation styres. Ved hjælp af denne model, vi for nylig rapporteret, at efter alvorlige hepatocyt tab, BECs udstrakt give anledning til regenererende hepatocytter 19, som blev yderligere bekræftet af to andre uafhængige undersøgelser 20,21. Derfor, sammenlignet med den førnævnte gnaver og zebrafisk leverskader modeller, vores hepatocyt ablation model er mere fordelagtig til at studere BEC-drevet leverregenerering.
Denne protokol beskriver proceduren for at udføre liver regenerering eksperimenter ved hjælp af zebrafisk hepatocyt ablation model. Denne model vil være passende til at bestemme mekanismerne bag galde-drevet lever regenerering og til kemiske skærme at identificere små molekyler, der kan undertrykke eller forøge lever regenerering.
Alvorlige, men ikke mild, hepatocyt ablation fremkalder galde-drevet leverregenerering. Derfor følgende Mtz behandling og udvaskning, er det vigtigt at undersøge leveren størrelse Mtz-behandlede larver, der kan vurderes ved iboende FFP fluorescens fra fabp10a: CFP-NTR transgen. Da en lille procentdel af Mtz-behandlede larver vil vise ikke-ablateret (0-5%) eller delvist ablated (10-20%) lever, er det vigtigt at sortere og kun analysere larver med en meget lille leveren, som indikerer alvorlig hepatocyt ablati…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |