Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la génération et l’imagerie d’une infection bactérienne localisée dans la vésicule otique du poisson zèbre.

Résumé

L'agent pathogène aquatique, Streptococcus iniae, est responsable de plus de 100 millions de dollars de pertes annuelles pour l'industrie de l'aquaculture et est capable de provoquer une maladie systémique dans les deux poissons et les humains. Une meilleure compréhension de S. maladie iniae pathogénie nécessite un système de modèle approprié. La traçabilité génétique et la transparence optique des premiers stades de développement du poisson zèbre pour permettre la génération et l'imagerie non-invasive de lignées transgéniques avec étiqueté par fluorescence des cellules immunitaires. Le système immunitaire adaptatif est pas complètement fonctionnel jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation, mais larves de poisson zèbre ont un système immunitaire inné de vertébré conservé à la fois les neutrophiles et les macrophages. Ainsi, la génération d'un modèle d'infection larvaire permet l'étude de la contribution spécifique de l'immunité innée dans le contrôle de S. infection iniae.

Le site de micro-injection permettra de déterminer si une infection estsystémique ou localisée initialement. Ici, nous présentons nos protocoles pour l'injection de vésicule otique du poisson zèbre âgés de 2-3 jours après la fécondation ainsi que nos techniques d'imagerie confocale de fluorescence de l'infection. Un site d'infection localisée permet l'observation de l'invasion microbienne initiale, recrutement des cellules hôtes et la diffusion de l'infection. Nos résultats en utilisant le modèle des larves de poisson zèbre de S. iniae infection indiquent que le poisson zèbre peut être utilisé pour examiner les différents apports de neutrophiles et les macrophages d'accueil dans les infections bactériennes localisées. En outre, nous décrivons comment photomarquage des cellules immunitaires peut être utilisé pour suivre le destin des cellules hôte individuel au cours de l'infection.

Introduction

Streptococcus iniae est un agent pathogène aquatique majeur qui est capable de provoquer une maladie systémique dans les poissons et les humains ^1. Bien que S. iniae est responsable de pertes importantes dans l'industrie de l'aquaculture, ce est aussi un agent pathogène zoonotique potentiel, capable de provoquer une maladie chez les hôtes humains immunodéprimés atteints de pathologies cliniques similaires à ceux causés par d'autres agents pathogènes humains streptocoques. Compte tenu de ses similitudes avec des agents pathogènes humains, il est important d'étudier S. iniae pathogenèse des maladies dans le contexte....

Protocole

Adultes et embryonnaires poisson zèbre ont été maintenus en conformité avec l'Université du Wisconsin-Madison recherche Ressources Animales Center.

1. Préparation de microinjection Aiguilles

1. Préparer aiguilles d'injection capillaire en verre de paroi mince (1,0 OD / 0,75 ID) en utilisant un dispositif micropipette extracteur avec les paramètres suivants: pression d'air 200, la chaleur 502, tirez 90, vitesse 80, heure 70, heure de l'air au début de la traction 5, temps d'antenne à la fin de la traction 5.
2. En utilisant des pinces fines, détacher la pointe de l'aiguille tiré sorte que l'ouvert....

Résultats

Microinjection de S. iniae dans la vésicule otique (Figure 1 et Figure 2) conduit à une réponse de l'hôte initialement localisée. Lorsqu'elle est injectée correctement, les bactéries doivent seulement être vu dans la vésicule otique et non dans le tissu ou le sang environnant. Ceci peut être visualisé au cours de la micro-injection en utilisant un colorant rouge de phénol (figure 1A). Alternativement, si bactéries marquées sont injectées, une analyse ra.......

Discussion

La méthode d'infection utilisé ici est utile pour l'étude de la réponse immunitaire de l'hôte à une infection localisée initialement dans 2 à 3 dpf embryons et les larves. La mise au point d'un stimulus inflammatoire, comme une infection, dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique permet l'étude de la chimiotaxie de neutrophiles et de macrophages et de phagocytose. Une mise en garde de l'injection de bactéries dans la vésicule otique est que la capacité des neutrophiles à phagoc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,7 ml Eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml Tube Falcon	BD Falcon	352059
27 G x ½ ; aiguille BD	Biosciences	305109
plaque à 96 puits	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
Sondes moléculaires rouges CellTracker	, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Pipettes de transfert jetables	Fisher Scientific	13-711-7m
Lunette de dissection	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Pince à épiler fine	Science Tools	11251-20
Peigne gel	VWR	27372-482	4,2 mm de largeur, 1,5 mm d’épaisseur
		à fond en verre	Fabriqué sur mesure en perçant un trou de 16 à 18 mm au centre d’un fond de plat de culture tissulaire de 35 mm et en plaçant une lamelle ronde #1 de 22 mm dans le trou et en scellant avec une fine couche d’adhésif optique Norland 68 durci à la lumière UV.
Glycérol	Fisher Scientific	G33-4
Agarose à haut point de fusion	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Peroxyde d’hydrogène	Fisher Scientific	H325
Microscope confocal à balayage laser	Olympus	avec système
Agarose à bas point	de fusion Fisher	BP165-25
Support magnétique	Tritech (Narishige)	GJ-1
Système de micro-injection	Parker	Picospritzer III
Embouts de pipette à microchargeur	Eppendorf	930001007
Micromanipulateur	Tritech (Narishige)	M-152
Extracteur de micropipettes	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Spectrophotmètre	Nanodrop Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourée (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Microscopie électronique Sciences	15710
Boîtes de Pétri	Fisher Scientific	FB0875712	100 x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Saline tamponnée au phosphate	Fisher Scientific	BP665-1
Hydroxyde de potassium	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Petite boîte de culture cellulaire	Corning Incorporated	430165	35 x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Aiguilles d’injection capillaire en verre à paroi mince	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaïne (3-aminobenzoate d’éthyle)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Extrait de levure	Fluka Biochemika	Référence 92144

Plats FV-1000