Rose Bengal Photothrombosis ved Konfokal Optical Imaging<em> In vivo</em>: En model af Single Vessel Stroke

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

Den beskrevne teknik tillader visualisering af in vivo cellulære reaktioner umiddelbart efter induktion af Rose Bengal photothrombosis i en intakt mus. Rose Bengal (4,5,6,7-tetrachlor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) er et fotofølsomt farvestof anvendes til at inducere iskæmisk slagtilfælde i dyremodeller (mus og rotter). Efter en bolusinjektion af RB gennem halevenen og efterfølgende bestråling gennem en fortyndet kranium med en 564 nm laserlys, er en thrombe induceret forårsager en fysiologisk slagtilfælde ^1. Metoden blev oprindeligt beskrevet af Rosenblum og El-Sabban i 1977, og blev senere tilpasset af Watson i midten af 1980'erne ^1,2. Kort fortalt Rose Bengal bestråles med grønt excitationslys (561 nm laser i vores tilfælde), som genererer produktion af reaktive oxygenarter, som efterfølgende aktiverer vævsfaktor, en initiator af koagulationskaskaden. Induktionen af ​​koagulationskaskaden frembringer en iskæmisk lesion, der er patologisk relevante for klinisk slagtilfælde ^3.

Slagtilfælde har en kompleks patofysiologi grund af samspillet mellem mange forskellige celletyper, herunder neuroner, glia, endothel og immunsystemet. Vælge den bedste teknik til at studere et særligt cellulær proces kræver flere overvejelser. Eksperimentelle teknikker falder bredt i en af tre kategorier: in vitro, in vivo og in silico med hver især har fordele og ulemper In vitro-undersøgelser har det primære ulempe at fjerne celler fra deres naturlige miljø, og derfor må ikke reproducere effekter set i en intakt,. levende dyr. In vivo teknikker yde øget eksperimentel replikation af sygdomstilstande med øget translationel betydning. I silico henviser generelt til computermodellering af en sygdom eller cellulær proces, og mens stigende grad anvendes til at studere potentielle lægemiddelinteraktioner for eksamenpel, skal alle oplysninger udledes stadig testes i levende celler eller væv.

Den ideelle model for slagtilfælde i indstillingen laboratorium bør demonstrere lignende patologiske funktioner til dem, der ses i den menneskelige befolkning. Mens der er fælles fysiologiske karakteristika af slagtilfælde i den humane population, er der også mange forskellige, alt afhængigt af typen af ​​skade oplevet. Slagtilfælde i den menneskelige befolkning sker som små eller store fartøjer okklusioner, blødende læsioner og arterie-til arterie eller cardio-blodpropper, der resulterer i forskellige infarktvolumener samt forskelle i mekanismer relateret til hver patologi. Fordelen ved animalsk slagtilfælde modeller er dannelsen af ​​reproducerbare infarkter, der efterligner karakteristika humant slagtilfælde. De mest almindelige dyr slagtilfælde modeller omfatter arterieokklusion hjælp: middle cerebral arterie okklusion (embolisk eller endovaskulære endeløse metoder), hvilke modeller distal MCAO og photothrombosis model. Fordelene end ulemper ved hver model er blevet gennemgået andetsteds (se ⁴ og ^5). Global iskæmiske modeller (MCAO), mens relativt let at udføre er mindre relevante for den menneskelige slagtilfælde end er fokale slagtilfælde modeller. Derudover er disse metoder meget varierende med inducere reproducerbare hjerne infarkt læsioner. Den photothrombosis model er meget reproducerbar, så længe eksperimentatoren styrer deres eksperimenter godt, hvilket giver en klar fordel i forhold MCAO modeller. Men på grund af mikrovaskulaturen fornærmelse modellen er blevet beskrevet at vise en minimal iskæmisk penumbraen, det område, hvor celler menes at være reddes ^6,7. Derudover kan vasogent ødem og cytotoksisk ødem også induceres efter bestråling af det billeddannende område. På trods af disse begrænsninger teknikken har givet ny indsigt i mange fysiologiske processer efter slagtilfælde ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Bemærk: Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Texas Health Science Center i San Antonio og var i overensstemmelse med de ANKOMMER retningslinjer. 1. bedøve for Kortikal Forberedelse Placer musen i en induktion kammer med 2-3% isofluoran blandet med ilt for at fremkalde anæstesi. Overhold fald respirationsraten som musen induceres. Klem poten af ​​musen for at afgøre, om musen er klar til at flytte til næsekeglen. Bem?…

Representative Results

Formålet med denne fremgangsmåde var at inducere en iskæmisk slagtilfælde i dyremodeller (mus og rotter) efter en bolusinjektion af RB gennem halevenen og efterfølgende belysning af en fortyndet kranium med en 561 nm laserlys. Billederne i figur 4 demonstrerer progressionen af koageldannelse inden for en enkelt beholder efter bestråling af området ved 0, 1, 1,5 og 2 min. Forud for koageldannelse hele fartøjet er hvidt på grund af fritflydende Rose Bengal. Efter induktion af bestråling af fart?…

Discussion

Evnen til at omsætte eksperimenterende slagtilfælde patofysiologi fra dyr til menneske ansøgning er blevet plaget med fiasko. Men brugen af ​​dyremodeller, såsom photothrombosis model, giver mulighed for en bedre forståelse af slagtilfælde patofysiologi og udforskning af nye terapeutiske tilgange til at levere neurobeskyttelse efter et slagtilfælde. Små kortikale strøg og microinfarctions produceret af photothrombotic model er klinisk relevant for subklinisk eller "tavse" slagtilfælde ^13-15,…

Materials

			Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
			[header]
			Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53