Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
अल्जाइमर रोग उम्र बढ़ने की आबादी को प्रभावित करने वाले एक neurodegenerative रोग है। बीमारी का एक प्रमुख नयूरोपथोलोगिकल सुविधा एमीलोयड-बीटा का अधिक उत्पादन और पीड़ित व्यक्तियों के मस्तिष्क क्षेत्रों में amyloid बीटा सजीले टुकड़े के बयान है। वर्ष के दौरान वैज्ञानिकों एमीलोयड-बीटा विकृति को दोहराने के लिए प्रयास है कि कई अल्जाइमर रोग के माउस मॉडल उत्पन्न किया है। दुर्भाग्य से, माउस मॉडल केवल चुनिंदा रोग विशेषताओं की नकल। Neuronal मौत, अल्जाइमर रोग के रोगियों के दिमाग में एक प्रमुख प्रभाव, ज़ाहिर इन चूहों में कमी है। न्यूरॉन्स के लिए सबसे जहरीले साबित हो गया है कि एमीलोयड-बीटा के रूपों – – इसलिए, हम और दूसरों को सीधे एमीलोयड-बीटा के घुलनशील oligomeric प्रजातियों के निवेश की एक विधि कार्यरत है stereotaxically मस्तिष्क में। इस रिपोर्ट में हम एक का चयन मस्तिष्क क्षेत्र में amyloid बीटा स्तर को बढ़ाने के लिए इस सर्जरी तकनीक दस्तावेज़ करने के लिए पुरुष C57BL / 6J चूहों का उपयोग।कोलीनर्जिक सर्किट से जुड़ा हुआ है कि बेसल अग्रमस्तिष्क के साथ-साथ यह मस्तिष्क संरचना, बीमारी में अध: पतन के क्षेत्रों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि आसव लक्ष्य हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस है। ब्रोका के विकर्ण बैंड के ऊर्ध्वाधर अंग में कोशिका मृत्यु और कोलीनर्जिक न्यूरॉन नुकसान में एक सहवर्ती वृद्धि हुई है, जबकि stereotaxic निषेचन के माध्यम से दांतेदार गाइरस में amyloid बीटा को ऊपर उठाने के परिणाम, 1 सप्ताह के भीतर दांतेदार गाइरस में न्यूरॉन नुकसान में वृद्धि का पता चलता है बेसल अग्रमस्तिष्क की। इन प्रभावों को 2 सप्ताह तक मनाया जाता है। हमारे डेटा वर्तमान एमीलोयड-बीटा अर्क मॉडल एक अल्पकालिक आधार में इस क्षेत्र के लिए विशिष्ट न्यूरॉन मौत को संबोधित करने के लिए एक विकल्प के माउस मॉडल प्रदान करता है कि पता चलता है। इस मॉडल का लाभ एमीलोयड-बीटा एक स्थानिक और लौकिक ढंग से उठाया जा सकता है।
एमीलोयड-बीटा (Aβ 1-42) से बना रहे हैं, जो Amyloid पट्टिका जमा, अल्जाइमर रोग (ई) की विकृति की एक प्रमुख विशेषता हैं। कई अध्ययनों से neuronal मौत, अन्तर्ग्रथनी डिस्ट्रोफी, हानि और शिथिलता बटोर पुनः संयोजक oligomeric Aβ 1-42 की है कि उच्च या विषाक्त स्तर से पता चला है; के रूप में अच्छी तरह से सीखने और स्मृति घाटे 1-4 के रूप में। प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस, कॉर्टेक्स, और बेसल अग्रमस्तिष्क और प्रमस्तिष्कखंड 5,6 के रूप में इस तरह के subcortical संरचनाओं शामिल हैं। तारीख करने के लिए विज्ञापन के Aβ 1-42 विकृति अनुकरण करने का प्रयास है कि कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल हैं। तनाव के आधार पर इन जानवरों ईस्वी का चयन करें रोग सुविधाओं की जांच करने में उपयोगी साबित होते हैं। दुर्भाग्य से, 2 ट्रांसजेनिक लाइनों, APP23 और 5XFAD के अपवाद के साथ, इन चूहों को पूरी तरह से न्यूरोनल हानि, विज्ञापन का एक महत्वपूर्ण पहलू को दोहराने कभी नहीं। यहां तक कि APP23 और 5XFAD में मनाया न्यूरोनल हानि, neuronal मौत obser साथवेद कुछ चुनिंदा क्षेत्रों 7,8 करने के लिए, सूक्ष्म उम्र निर्भर है, और पृथक किया गया।
जंगली प्रकार माउस मस्तिष्क में oligomeric Aβ 1-42 के प्रत्यक्ष अर्क amyloidopathy 1,9,10 के neuronal मौत पहलू प्रतिकृति जो vivo मॉडल में एक उत्कृष्ट प्रदान करता है। आमतौर पर उपयोग किया ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के विपरीत oligomeric Aβ 1-42 अर्क मॉडल तीव्रता से एक स्थानिक और लौकिक ढंग से Aβ 1-42 के स्तर को ऊपर उठाने के लिए आदर्श है। इस मॉडल के लिए जंगली प्रकार चूहों का उपयोग करने का लाभ यह है कि ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में पेश म्यूटेशन से संभावित मुआवजा या साइड इफेक्ट अनावश्यक। विगत पढ़ाई हिप्पोकैम्पस में Aβ 1-42 के विषाक्त स्तर infusing 1 सप्ताह 1 भीतर इंजेक्शन स्थल के आसपास के क्षेत्र में न्यूरॉन मौत elicits दिखाया है। इसके अलावा, Aβ 1-42 कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स 11 बेसल अग्रमस्तिष्क के लिए विषाक्त अवलोकन के साथ संगत है किहिप्पोकैम्पस के लिए परियोजनाओं जो कोलीनर्जिक न्यूरॉन (BFCN) जनसंख्या प्रभावी रूप से मस्तिष्क में पृथक न्यूरोनल circuitry की परीक्षाओं के लिए अनुमति देता है, चूहों में बीटा amyloid अर्क 1,10 निम्नलिखित 7-14 दिनों के भीतर 20-50% की कमी हुई है। अधिकांश भाग के नियंत्रण / वाहन और oligomeric Aβ 1-42 समाधान के लिए हिप्पोकैम्पस 12 की दांतेदार गाइरस, को ipsilaterally BFCN परियोजना के बाद से तुलना बाएँ और दाएँ गोलार्द्धों के बीच 1 किए जाने के लिए अनुमति देने के मस्तिष्क के दोनों तरफ इंजेक्ट किया जा सकता है।
इस रिपोर्ट में हम वयस्क जंगली प्रकार C57BL / 6J चूहों के लिए एक विस्तृत शल्य चिकित्सा और इंजेक्शन पद्धति प्रदान करेगा। यह माउस तनाव की वजह से अनुसंधान के क्षेत्र में अपने व्यापक उपयोग की चुन लिया जाता है। तकनीकी तौर पर, किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र लेकिन यहाँ हम तकनीक को वर्णन करने के लक्ष्य के रूप में हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस का उपयोग करेगा, संचार के लिए निशाना बनाया जा सकता है।
1) सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करें;: प्रयोगकर्ता या सर्जन चाहिए एक सफल Aβ 1-42 इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए 2) सही ढंग से सटीक निर्देशांक के साथ ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान; 3) ठीक से एपी और एमएल अ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित और स्ट्रोक अल्जाइमर रोग अनुसंधान वित्त पोषित उम्र बढ़ने पर (CMT के लिए) NS081333, अल्जाइमर एसोसिएशन अनुदान NIRG-10-171721 और (उह करने के लिए) मानसिक स्वास्थ्य अनुदान MH096702 के राष्ट्रीय संस्थान, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ अनुदान दिया गया था (YYJ और जेबी के लिए) कोलंबिया विश्वविद्यालय पायलट अनुदान AG008702 पर केंद्र।
Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
#3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
#11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |