Abstract
أثناء التطور بعد الولادة، الخلايا الحبيبية غير ناضجة (interneurons مثير) يحمل الهجرة عرضية في الطبقة الحبيبية الخارجية، والهجرة ثم شعاعي في طبقة الجزيئية وطبقة الخلايا العصبية للوصول إلى الطبقة الحبيبية الداخلية للقشرة المخ. الافتراضي في عمليات الهجرة يدفع إما موت الخلايا أو في غير موضعها من الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى عجز في وظائف المخيخ متنوعة. تتضمن الجاذبية هجرة الخلايا الحبيبية عدة آليات، مثل الكيميائي وتدهور المصفوفة خارج الخلية، لتوجيه الخلايا نحو موقفهم النهائي، ولكن لا يعلمها إلا جزئيا العوامل التي تنظم الهجرة خلية في كل طبقة قشرية. في أسلوبنا، يتم إعداد شرائح للدماغ الحادة من P10 الفئران، وصفت الخلايا الحبيبية مع علامة حشوية الفلورسنت والأنسجة ومثقف على إدراج غشاء 4-10 ساعة قبل بدء رصد في الوقت الحقيقي من الهجرة الخلية عن طريق الفحص العياني متحد البؤر عند 37 درجة مئوية فيوجود CO 2. أثناء هجرتها في الطبقات القشرية مختلفة من المخيخ، والخلايا الحبيبية يمكن أن يتعرض لمنبهات نيوروبيبتيدي أو الخصوم، مثبطات الأنزيم البروتيني، حاصرات من المؤثرات داخل الخلايا أو المواد السامة حتى مثل الكحول أو ميثيل الزئبق للتحقيق في دور محتمل في تنظيم الهجرة العصبية .
Introduction
في المخيخ النامية، ثمانية أنواع مختلفة من الخلايا العصبية تنتج بالتسلسل بين الأسبوع الجنينية الثاني والأسبوع الثاني بعد الولادة في القوارض 1. تنشأ في البداية من، منطقة جرثومي الأولية، الخلايا الحبيبية غير ناضجة (GC) هي الخلايا العصبية الماضية إلى أن يتم إنتاجها من طبقة خارجية الحبيبية (EGL)، منطقة جرثومي ثانوي 2. خلال ثلاثة أسابيع بعد الولادة الأولى، وقشرة المخيخ هو بنية رقي نظمت في أربع طبقات بما في ذلك EGL، وطبقة الجزيئية (ML)، وطبقة الخلايا العصبية (PCL) والطبقة الحبيبية الداخلية (IGL) (الشكل 1). من خلال الهجرة الجاذبية، غير ناضج GCS، interneurons glutamatergic، وصول إلى IGL غضون ما يقرب من 2 يوما. في الأسبوع ما بعد الولادة الثالث، وEGL يختفي ويشكل IGL ما يسمى الطبقة الحبيبية (GL) في المخيخ الكبار. في GL، GCS حصول على مدخلات متشابك مثير من الألياف المطحلب والخلايا فرشاة القطب الواحد، ومدخلات متشابك المثبطة من محاور الخلايا جولجي. في ML، المحاور GC تجعل نقاط الاشتباك العصبي مثير مع الخلايا العصبية GABAergic بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا سلة، والخلايا النجمية، والخلايا جولجي 2.
مراقبة الوقت الحقيقي من حركة الخلايا في المخيخ شرائح الحادة التي تم الحصول عليها من القوارض بعد الولادة المبكرة يدل على أن GCS تعديل شكلها بالتزامن مع التغييرات في طريقة وسرعة الهجرة خلال طريقهم في قشرة المخ 3. خلال أول أسبوعين بعد الولادة، السلائف GC تتكاثر بنشاط في الجزء العلوي من EGL. في الجزء الأوسط من EGL، تالية للتفتل GCS الهجرة بشكل عرضي في اتجاه عملية أكبر بهم. على الحدود EGL-ML، GCS بطء حركتها، فإن الخلايا تبدأ في الدخول في عملية الهابطة عمودية قصيرة في ML. في ML، GCS لديها خلايا الجسم ممدود عموديا، وهي عملية زائدة رقيقة وعملية تؤدي أكثر ضخمة، وترحيل شعاعيا على طول الألياف الدبقية بيرجمان. فيPCL، GCS وقف حركتهم ولكن بعد مرحلة ثابتة لفترات طويلة (2 ساعة)، وعبور الحدود PCL-IGL. في IGL، GCS تهاجر نحو الجزء السفلي من طبقة في غياب الدعم الألياف الدبقية. مرة واحدة على نصائح من العملية المؤدية الاقتراب من الحدود مسألة IGL البيضاء (WM)، GCS بطيئة ووقف حركتهم. ويفضل المقاطع العرضية من المخيخ لدراسات الهجرة عرضية في EGL في الوقت الذي يكرسون شرائح السهمي إلى شعاعي الهجرة في ML، PCL وIGL. بعض العوامل التنظيمية للحركات GC بما في ذلك نيوروببتيد (على سبيل المثال، السوماتوستاتين، PACAP) تم التعرف حتى الآن ولكن آليات متكاملة تشارك في السيطرة المكانية والزمانية للهجرة GC في كل طبقة قشرية لا تزال 1،4،5،6 معروفة إلى حد كبير.
وقد تمت دراسة الهجرة GC خلال 20 عاما الماضية من خلال أشرطة الفيديو ومتحد البؤر المجهري باستخدام الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن الخلايا المستزرعة معزولة أو الكشف عن مضان لإبرةشرائح المخيخ الشركة المصرية للاتصالات. استخدمت الجاذبة للدهون في البداية، ومؤخرا "المقتفي خلية" الأصباغ وأعرب الخلية البروتينات الفلورية للمتحد البؤر أو اثنين من الفوتون المجهري 7،8. التجارب الناجحة تعتمد على عدد من الإجراءات المحددة التي تجعل من بروتوكول بسيطة ولكن ليس من السهل. على وجه الخصوص، شرائح الحادة يجب أن استقرت خلال الملاحظات بشكل عام مع النايلون شبكة شبكة محلية الصنع 9. شدة الإضاءة الخفيفة يجب أن تكون في أدنى مستوى ممكن لتجنب الضيائية وphotobleaching من النحو الذي اقترحه مسح متعددة نهج المجهر متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك، درجة الحرارة وCO 2 هي المعايير البيئية الرئيسية منذ عدم الاستقرار قد تؤثر هجرة الخلايا العصبية. لتسهيل وتحسين الإجراءات التجريبية، قمنا بتطوير بروتوكول الفحص العياني متحد البؤر التي تحد من تحركات شريحة، ويضمن المعايير البيئية المستمرة، ويقلل من photobleaching من، ويزيد من مجال الرؤية (بناء على أمر من مليمتر) وconsequمستديم عدد الخلايا (عشرات) التي يمكن تتبعها من خلال تحليل الصور. وهكذا، 180 ميكرون شرائح سميكة يتم تربيتها على إدراج الغشاء، ويتم نقل 6 لوحات جيدا مباشرة تحت هدف 2X بمحرك من macroscope متحد البؤر التجارية مجهزة حضانة كبيرة الغرفة ودرجة الحرارة وCO 2 وحدات التحكم ونظام التحكم في الاهتزاز. ثم يتم تنفيذ الوقت الهفوات وض مداخن على مدى عدة ساعات وأدوات الدوائية أو الجزيئات النشطة بيولوجيا يمكن إضافة أو تسليمها في المتوسط الحضانة. ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها لدراسة هجرة أنواع أخرى من الخلايا العصبية في المخيخ أو المخ في مراحل النمو المختلفة.
Protocol
الحيوانات (ذكرا أو أنثى فئران ويستار) ولدت ونشأت في منشأة الحيوان المعتمدين (موافقة B.76-451-04)، وفقا لدليل الفرنسي لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وأجريت التجارب تحت إشراف المحققين المرخص (MB، DV وLG) وفقا لتوجيهات مجلس الاتحاد الأوروبي (2010/63 / UE من 22 سبتمبر 2010) وزارة الزراعة الفرنسية.
1. إعداد وسائل الإعلام وأدوات
- في خزانة السلامة البيولوجية، وإعداد BSS 1X هانك (HBSS) في الماء المعقم من 10X حل سهم تحتوي على CaCl 2 (1.85 جم / لتر) / MgSO 4 (0.9767 جم / لتر) دون MgCl 2. إضافة NaHCO 3 (350 ميكروغرام / مل) إلى 1x أخرى حل HBSS.
- في خزانة السلامة البيولوجية، إضافة N2 ملحق (من محلول المخزون 100X) والبنسلين (100 وحدة / مل) -streptomycin (0.1 ملغ / مل) الحل لتعديل النسر المتوسط (DMEM) مزيج من المغذيات Dulbecco لالبنية F-12 (1: 1).
- في ظروف معقمة، وإعداد قسامة (25 ميكرولتر، 2 مم) من حشوية الفلورسنت صبغة تسمى خلية المقتفي الخضراء في DMSO (1.075 مل 1 ملغ). تمييع قسامة واحدة في 5 مل من DMEM في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إعداد شغل الجليد دلو للحفاظ على وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية.
- تطهير مختبر قمم مقاعد البدلاء والأدوات مع 70٪ من الإيثانول.
2. تشريح المخيخ من الفئران P10
- قطع رأس بسرعة الفئران الوليدة (P10) مع مقص التشغيل المنحنية وراء الأذنين من أجل الحصول على بداية الحبل الشوكي.
- في الجانب الخلفي من رأس مقطوع، وجعل خط الوسط شق الجلد من الرقبة إلى الأنف مع قزحية غرامة مقص وفصل الجلد من الجمجمة مع قزحية غرامة مقص وملقط دومون # 3.
- استخدام مقص القزحية الجميلة لجعل بدقة اثنين من الشقوق الجانبية من القاعدة إلى المنطقة منقاري من الجمجمة. إزالة الجمجمة تشريح مع اثنين # 3 ملقط. فصل حمالة الصدرفي من أي التزام مع الجمجمة باستخدام نفس ملقط.
- نقل الدماغ مع نهاية ملعقة من ملعقة إلى طبق بتري (Ø 35 مم) التي تحتوي على 2 مل من الجليد الباردة HBSS المتوسطة.
- وضع طبق بتري تحتوي على الدماغ في طبق بتري أكبر (Ø 100 مم) كامل من الثلج ونقلها إلى مرحلة من مراحل stereomicroscope.
- تحت stereomicroscope وعزل المخيخ من الدماغ عن طريق تفلع باستخدام اثنين # 3 ملقط. وبالمثل، وإزالة الحبل الشوكي المتبقية وغشاء حنوني.
- نقل المخيخ في طبق بيتري HBSS شغل جديد (Ø 35 ملم، 2 مل) مع نهاية ملعقة من ملعقة والحفاظ على الجليد.
3. إعداد الحاد مخيخي شرائح
- تحت stereomicroscope، وقطع المخيخ بين دودة والنصف الأيمن كما هو مبين من قبل رؤساء اثنين السهم في الشكل 2A مع معيار مقبض مشرط # 3 الصلبة و# 15 شفرة جراحية.
- وضع قطرة واحدة من السماويالغراء oacrylate على vibratome عينة القرص وانتظر 15-25 ثانية للقضاء على أبخرة المذيبات السامة.
- جمع قطع المخيخ مع نهاية ملعقة من ملعقة وإزالة الزائد HBSS مع مناشف ورقية نظيفة.
- جلب المخيخ قريب من القرص العينة. إصلاح قطع حافة القرص العينة وانتظر 10 ثانية.
- أدخل القرص العينة في علبة عازلة مع مناور، وتناوب عليها حتى محور عرضية من المخيخ هو عمودي على حامل السكين. إصلاح القرص العينة مع مفتاح ألين وملء بلطف علبة عازلة مع HBSS متوسطة حتى يتم تغطية المخيخ.
- تحميل سحق الجليد في حمام التبريد.
- تنظيف شفرة ثلاث مرات مع 70٪ من الإيثانول للقضاء على أي نفط.
- إدراج شفرة في حامل السكين وآمنة مع لقط المسمار.
- وضع الحق حافة شفرة وراء الحافة الخلفية (من رأي المستخدم) من العينة وتحديد ذلك كنقطة انطلاق. استخدام الأمام الأمر لتحديد رانه نقطة النهاية بعد الحافة الأمامية للعينة.
- حدد باجتزاء السرعة 2.5 وباجتزاء تردد في 8. اختر سمك تقليم في 180 ميكرون. بدء باجتزاء الأنسجة.
- تلتقط كل قسم باستخدام الزجاج واسعة الجوف اقتطاع ماصة باستير ونقلها إلى HBSS التي تحتوي على طبق بتري (Ø 35 ملم) أبقى على الجليد.
- باستخدام اثنين من ملقط # 5، وإزالة السحايا بعناية من المخيخ عند التدخل في النصل. جمع بحد أقصى 5 شرائح في المخيخ (الشكل 2B، C).
- إزالة السحايا من شرائح المخيخ بعناية مع اثنين # 5 ملقط تحت stereomicroscope وفصل الفصيصات بلطف لأفضل التحقيق التحميل.
4. نيون تلون Interneurons المعيشة
- نقل شرائح للدماغ مع ماصة باستير الزجاج واسعة الجوف اقتطاع إلى لوحة 6 جيدا (بحد أقصى 3 شرائح / لكل بئر). نضح المتوسطة HBSS.
- احتضان شرائح (3 ماكس) في 5 مل من لحل oading من صبغة الفلورسنت (10 ميكرومتر).
- للحماية من الضوء، وتغطي صفيحة ميكروسكوبية بورق الألمنيوم. وضعه على طاولة الدوران الحركة في 35 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في RT لتسهيل وضع العلامات الخلية.
- شرائح نقل على غشاء من Transwell إدراج (3.0 ميكرومتر حجم المسام؛ الشكل 2D) مع ماصة باستير الزجاج واسعة الجوف اقتطاع. نضح المتوسطة التحميل مع ماصة.
- إزالة إدراج وملء البئر مع 1.9 مل من DMEM. استبدال إدراج وإضافة 100 ميكرولتر من DMEM على أعلى شريحة لتغطية الأنسجة.
- وضع لوحة تحتوي على إدراج الثقافة في غرفة الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) لمدة 2 ساعة وهو ما يكفي لمراقبة GCS في ML. تكمن الأنسجة مسطحة للسماح المرفق على غشاء إدراج (الشكل 2E). تأكد من أن شرائح لا تجف.
5. خارج الحي التصوير من خلال متحد البؤر الفحص العياني
- نقل لوحة من دونالغطاء البلاستيك في حاضنة تعلق على موقف من macroscope متحد البؤر. وضع غطاء زجاجي على إدراج لوحة من macroscope. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة في 37.0 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية، وتوريد شرائح مع تدفق الغاز ثابت (95٪ O 2، 5٪ CO 2) من خلال لوحة إدراج للحفاظ على ثبات درجة الحموضة. الانتظار لمدة 2 ساعة إضافية قبل التجربة مرور الزمن.
- المسافة إلى تصور الهجرة GC في شرائح الأنسجة، وإلقاء الضوء على التحضير مع 488 نانومتر ضوء الطول الموجي من خلال ليزر ديود من خلال متحد البؤر macroscope المسح بالليزر مجهزة الهدف الجاف X2 (العمل: 39 مم، الإطارات: 58 ملم، NA = 0.234)، وكشف عن انبعاث مضان 500-530 نانومتر.
- لحل ناعما حركة GCS، الحصول على صور مع عامل زووم بصري إضافية بين 1.5 و 2.0. جمع الصور من حلول الشبكات الخليجية في طائرة تنسيق وحيد أو ما يصل إلى 10 طائرات التنسيق مختلفة على طول محور Z كل 30 دقيقة لمدة تصل إلى 12 ساعة.
تتبع 6. خلية
- في كل مرة من الفيلم، نفذ إسقاط ض كومة من خلال وضع ecart من نوع في يماغيج. تعدل وعلى النقيض من مستويات السطوع من الصور المتعاقبة لتسهيل تحديد وتتبع GCS المسمى. خريطة يدويا في كل موقف على لقطة المرجعية (في تي = 0).
- استخدام "دليل تتبع" المساعد في القائمة الجسيمات تحليل وتحديد بالضغط على نقطة الثقل في كل خلايا الجسم أثناء مرور الزمن. تصدير بيانات تتبع الخام في جدول بيانات.
- إعادة تنظيم بيانات تتبع الخام المصدرة من يماغيج مع برنامج الذكية الصنع (http://primacen.fr، وكتب في كود PHP) التي تحدد كل خلية والمواقف المرتبطة بها. باستخدام هذا البرنامج، calculatالبريد المسافة الإجمالية سافر ومتوسط سرعة الهجرة لكل خلية. تصنيف ومقارنة خصائص الهجرة الخلية في ظروف مراقبة والعلاج تحت الفلاتر المناسبة باستخدام نفس البرنامج.
Representative Results
في المخيخ ما بعد الولادة في وقت مبكر، GCS يحمل تغييرات كبيرة في الوضع وسرعة الهجرة لأنها عبور مختلف الطبقات القشرية 1 (الشكل 1). يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال دراسة الهجرة GC في الوسط الخلوي الطبيعية. يتم فحص الفئران P10 شرائح الأنسجة المخيخ المسمى مع صبغة الفلورسنت الأخضر تحت macroscope متحد البؤر (الشكل 3A)، وتبين لنا أن GCS ترحيل شعاعيا في ML بمتوسط سرعة 18 ميكرون / ساعة (الشكل 3B، C). حتى الآن، ودور التفاعلات / الاتصالات بين الخلايا العصبية والدبقية بما في ذلك العوامل التنظيمية والآليات الجزيئية تشارك في السيطرة على الهجرة خلية في كل طبقة قشرية غير معروفة إلى حد كبير. وبالتالي، فإن القضية الرئيسية هي تحديد نيوروببتيد، العصبية، neurotrophins ومكونات المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تلعب دورا في هذه الطبقات القشرية SPECIالتغييرات المرورية من خلال سرعة عملية هجرتهم. تم الكشف عن النخامية أدينيلات-تفعيل محلقة ببتيد (PACAP) بشكل رئيسي في PCL، ولكن أيضا في ML وIGL خلال أول أسبوعين بعد الولادة في القوارض 7،10،11. أدى تطبيق PACAP38 (10 -6 M) إلى مستنبت في انخفاض سرعتها 79٪ من GC في ML. على سبيل المثال، انخفضت سرعة هجرة GCS في ML من 11.9 ميكرون / ساعة في ظروف السيطرة إلى 2.5 ميكرون / ساعة بعد إعطاء PACAP38 (الشكل 4A). الأنسجة من نوع المنشط plasminogen (TPA) هو عضو في سلسلة بروتين الذي يؤدي إلى تدهور مكونات المصفوفة خارج الخلية (EM) مثل جزيئات التصاق الخلية أو laminin 12،13. سكتة والبلازمينوجين، ركيزة من سكتة، تم الكشف في الطبقات القشرية خلال تطوير المخيخ 14،15،16 بعد الولادة. إدارة PAI-1 (10 -7 M)، المانع من الذاتية سكتة، وانخفاض بنسبة 78٪ في GCالهجرة في ML. على سبيل المثال، خفض GCS سرعة الهجرة في ML من 19.2 ميكرون / ساعة في ظروف السيطرة إلى 4.2 ميكرون / ساعة بعد إضافة PAI-1 (الشكل 4B). هذه النتائج تشير إلى أن PACAP يمارس تأثير كابح بشكل مباشر على حركات GC وأن سيرين البروتيني سكتة تسهل هجرة GCS في ML من المخيخ الفئران النامية.
الشكل 1: تمثيل 3D الهجرة GC في قشرة المخ بعد الولادة. 4/1، تمديد عمليات GC والهجرة عرضية في EGL. 5، والهجرة شعاعي في ML جنبا إلى جنب بيرجمان الألياف الدبقية. 6، مرحلة ثابتة عابر في PCL 7 والهجرة الدبقية مستقلة شعاعي في IGL 8، استكمال الهجرة GC في IGL GC، الخلية الحبيبية، باللون الأحمر؛ EGL، الطبقة الحبيبية الخارجية؛ B، بيرجمان الدبقية، في الأرجواني الداكن، G، خلية جولجي، باللون الأصفر؛ قوات التحالف، والألياف التسلق، باللون الأزرق، ز، الخلايا الحبيبية postmigratory، في ضوء الأخضر؛ IGL، الطبقة الحبيبية الداخلية؛ MFT، والألياف المطحلب المحطة، باللون الأخضر الداكن، ML، طبقة الجزيئية؛ P، الخلية العصبية، في الأرجواني الخفيفة؛ طبقة الخلايا PCL، العصبية. تم تعديل هذا الرقم من 5.
الشكل 2: خارج الحي ثقافة شرائح P10 المخيخ (A) المخيخ تشريح من الفئران P10. شريط النطاق = 6 مم. (B) صورة مجهرية المعيشة 180 شريحة المخيخ ميكرون سميكة من خلال stereomicroscopy. شريط النطاق = 3 مم. (C) فيالتكبير العالي، والطبقات القشرية الأربعة (EGL، ML، PCL، IGL) من المخيخ ومميز بالفعل. شريط النطاق = 1 مم. (D) بعد وضع العلامات الفلورية، يتم وضع شرائح الأنسجة على إدراج الثقافة (24 مم) في لوحة 6 جيدا. (E) تمثيل تخطيطي لإدراج الثقافة مع غشاء البوليستر زراعة الأنسجة المعالجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: الهجرة دينامية GCS في الطبقات القشرية من P10 الفئران المخيخ (A) نظرا Macroconfocal (XYZ، والإسقاط 2D) من شريحة المخيخ الفئران P10 التي وصفت GCS مع الأخضر صبغة الفلورسنت حشوية. = شريط نطاق 75 ميكرون. (B) الوقت الفاصل بين التصوير تظهر GCالحركات في ML بواسطة الفحص العياني متحد البؤر لمدة 4 ساعة في ظروف السيطرة. النجمة (*) يمثل رمزا سوما GC. يشار إلى الوقت الذي انقضى (في دقيقة) على الجزء السفلي من كل صورة مجهرية. = شريط نطاق 10 ميكرون. (C) تغييرات متتابعة في المسافة التي يقطعها GC سوما.
الرقم 4: تأثير نيوروبيبتيدي ومثبط البروتياز الهجرة GC كانت تتبع (A) GC في ML بواسطة الفحص العياني متحد البؤر لمدة 2 ساعة في ظروف السيطرة ومن ثم لمدة 2 ساعة في وجود الغدة النخامية أدينيلات-تفعيل محلقة ببتيد (PACAP). وتعقب (B) GC في ML التي كتبها الفحص العياني متحد البؤر لمدة 2 ساعة في ظروف السيطرة ومن ثم لمدة 2 ساعة في وجود منشط البلازمينوجين المانع-1 (PAI-1).
Discussion
يصف هذا البروتوكول ثقافة الفئران P10 شرائح للدماغ الحادة في النظام Transwell ووضع العلامات الفلورية من GC مع صبغة الفلورسنت الأخضر لدراسة الهجرة الخلية أثناء التطور بعد الولادة من خلال الفحص العياني متحد البؤر. هذا البروتوكول يسمح الملاحظات للهجرة الخلايا لمدة تصل إلى 12 ساعة واختبار الأدوار المحتملة لتنظيم العوامل في الهجرة بما في ذلك منبهات أو الخصوم من نيوروببتيد، مثبطات الإنزيم، مما يشير إلى خلية جهري أو المواد السامة أثناء التجربة. ثقب صغير في إدراج الغشاء مع طرف ماصة ضروري لتسهيل إدارة المركبات في المتوسط الحضانة. ويمكن استخدام المنحنية غيض ماصة محلية الصنع لتسهيل إيصال الحل.
قضية واحدة من دراسات الهجرة الخلية الحية على شرائح الأنسجة هي أن تحركات الأنسجة نفسها يمكن أن تتبع الخلية الصعبة. في حين اقترح النهج السابقة لتحقيق الاستقرار بلطف سليالمجال الاقتصادي الموحد مع النايلون شبكة أو طبقة رقيقة من ذيل فأر الكولاجين 7،17، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو نقل بسيطة ومباشرة من لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على شرائح للدماغ على إدراج غشاء من الحاضنة CO 2 في إطار الهدف من macroscope متحد البؤر. كما توفر درجة الحرارة متكاملة وCO 2 وحدات التحكم العوامل البيئية المناسبة والمستمرة ضرورية لهجرة الخلية 9. لذلك، يتم الاحتفاظ الظروف والثقافة خلال الملاحظات والحركات الأنسجة إلى أدنى حد ممكن حيث أن تعلق شرائح جيدا لإدراج الغشاء. يتم التحقق من استقرار النسيج باتباع موقف حواف شريحة أو الخلايا العصبية التي ينبغي أن تكون ثابتة مراجع خلال الاستحواذ. بالإضافة إلى ذلك، شرائح للدماغ (بين 12 و 18) وزعت في 6 آبار من لوحة يمكن ملاحظة بسرعة بالتفصيل مع مرحلة الآلية وزووم بصري. نظرا لبعد المسافة الكبيرة العاملة (X2، 39 مم) هدف الجاف، وبرنامج التحصين الموسع-observation خالية من الغمر وإدارة المركبات في مستنبت هو أسهل من ذلك بكثير. ولذلك، المعايير البيئية والتشابه لدعم الثقافة في CO 2 الحاضنة ومتحد البؤر الفحص العياني يؤدي إلى الحفاظ على الحد الأقصى من العينة البيولوجية.
ميزة أخرى للبروتوكول في مجال واسع من الرأي، وبالتالي عدد كبير من الخلايا التي يمكن ملاحظتها في وقت واحد. على سبيل المثال، فقد قررنا سابقا أن كثافة GCS الفلورسنت مع الهجرة شعاعي في ML كان 1124 ± 138 خلية / ملم 2 18. الفحص العياني متحد البؤر (X2، NA = 0.234) لديه دقة أقل الجانبي مقارنة متحد البؤر المجهري (40X، NA = 1.25) ولكن الخلية يمكن تتبع جثث GCS بسهولة ومتوسط سرعة الهجرة غير قابلة للمقارنة بين تقترب من التكنولوجية اثنين 7،18 .
إلى جانب تحسن التقنية للقيام بعمليات استحواذ الصورة، ونوعية من شرائح الأنسجة والعشرينجودة (ه) من العلامات هي النقاط الرئيسية للتجارب الناجحة. دائما وسائل الاعلام والأنسجة على الجليد أثناء عمليات تشريح، والقضاء على النفط على vibratome شفرات ولا تستخدم شرائح من الأنسجة في اتصال مع الغراء. يتم تكييفها أقسام السهمي وعرضية لشعاعي والهجرة عرضية على التوالي. استخدام أطوال مختلفة من الحضانة للكشف المناسب في الطبقات القشرية مختلفة من المخيخ. أوقات طويلة الحضانة (تصل إلى 8 ساعات) ضرورية للكشف عن هجرة العديد من GCS في PCL وIGL. منذ الهجرة GC هي عملية فيزيولوجية خلال النوافذ المكانية والزمانية محددة، والسيطرة الإيجابية هي أن الخلايا لديها إلى الهجرة بشكل صحيح. على وجه الخصوص، العديد من GC المغزل في ML هي واحدة من المؤشرات الصحية الرئيسية لشرائح المخيخ السهمي. لبدء التجارب، ويقترح مراقبة تحركات GC في ML. في الواقع، ينبغي النظر في شكل GC مع ممدود عموديا خلايا الجسم كنقطة مرجعية لبدء ميلانquisition مع مراقبة متتالية (2 ساعة) والعلاج (2 ساعة) الفترات التي يمكن القيام بها بسهولة في ML.
الأصباغ الفلورية مثل عائلة تعقب خلية أو البروتينات الفلورية التعبير عنها من خلال بنيات وراثية ويمكن استخدام كأثر للدراسات الهجرة الخلية. ونظرا لحركية بطيئة للهجرة GC (1 كومة كل 30 دقيقة)، والتجارب متعدد الألوان ويمكن أيضا أن يؤديها في وضع متتابعة منذ 4 الليزر الحزم (405، 488، 532 و 633 نانومتر) متوفرة على النظام. وبالنظر إلى الجاذبية والطرد المركزي الهجرة شعاعي، وتتبع من interneurons أخرى يمكن أيضا أن تتحقق 18. على وجه الخصوص، وأقل أنواع الخلايا عديدة يمكن أن تكون مترجمة أكثر سهولة مع حقل كبير للعرض. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الهجرة الخلية في مراحل أخرى من تطوير للدماغ ولكن أيضا مناطق الدماغ الأخرى.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد للبحوث والابتكار في الطب الحيوي (IRIB)، ومنهاج التصوير خلية من نورماندي (PRIMACEN)، INSERM، IBiSA، وجامعة روان، الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (ERDF - PeReNE، الأقاليمي 4A)، وLARC-العصبية شبكة والمنطقة هوت نورماندي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10x | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| Biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| Adjustable-volume pipette (0.5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| Gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| Vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| Confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| Temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| Standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| Surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H.
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
