Этот протокол предназначен для извлечения и концентрирования белка и ДНК из микробной биомассы, собранной из морской воды, с последующим получением триптических пептидов, подходящих для протеомного анализа на основе тандемной масс-спектрометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мета-омические технологии, такие как метагеномика, метатранскриптомика и метапротеомика, могут помочь в понимании структуры микробного сообщества и метаболизма. Несмотря на свою мощь, метагеномика сама по себе может пролить свет только на функциональный потенциал. С другой стороны, метапротеомика позволяет описать экспрессируемый in situ метаболизм и функцию сообщества. Здесь мы опишем протокол лизиса клеток, выделения белков и ДНК, а также расщепления пептидов и экстракции из морских микробных клеток, собранных на картриджной фильтрующей установке (например, фильтрующей установке Sterivex) и сохраненных в растворе для стабилизации РНК (например, RNAlater). В исследованиях протеомики, основанных на масс-спектрометрии, идентификация пептидов и белков выполняется путем сравнения масс-спектров пептидных тандемов с базой данных транслируемых нуклеотидных последовательностей. Включение метагенома образца в поисковую базу данных увеличивает количество пептидов и белков, которые могут быть идентифицированы по масс-спектрам. Следовательно, в этом протоколе ДНК выделяется из того же фильтра, который впоследствии может быть использован для метагеномного анализа.
Введение
Микроорганизмы вездесущи и играют существенную роль в биогеохимических циклах Земли 1. В настоящее время существует множество подходов молекулярной доступные для характеристики структуры микробного сообщества и функции. Наиболее распространенным является анализ гена 16S рРНК ПЦР-амплифицировали из ДНК окружающей среды 2 - 4. Недостатком анализа генов 16S рРНК, что это только предоставляет информацию о филогенетического идентичности и структуры сообществ, с мало информации о метаболической функции. В отличие от этого, подходов, таких как метагеномика, metatranscriptomics и metaproteomics предоставить информацию о структуре и метаболизме сообществ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовьте Реагенты
- Подготовьте SDS-экстракционного раствора: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА и 1% SDS. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при 4 ° С.
- Подготовка акции реагенты, необходимые для полиакриламидном геле.
- Готовят 1,5 М Трис-НСl рН 8,8. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
- 0,5 М Трис-НСl рН 6,8. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
- Подготовка 10% SDS. Фильтр стерилизуют, используя фильтр и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
- Готовят растворы, н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В качестве демонстрации, мы провели протокол на двух пробах морской воды, собранных с поверхности и хлорофилла максимум прибрежных районах океана в Северной Канаде. В то время как в море, 6-7 л морской воды, пропускали через GF / D префильтр 3 мкм, а затем микробные клетки собирали на единицу патронный фильтр 0,22 мкм в соответствии с протоколом Уолша и др., 20. Клетки немедленно сохраняются в стабилизации раствора РНК до дальнейшей обработки. По возвращении в лабораторию, мы провели протокол, как эт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Образец сохранение является ключом к metaproteomic исследований и предыдущая работа показала, что раствор стабилизации РНК является полезным буфер хранения для хранения клеток до извлечения белка 28. В идеале, образцы будут сохранены на месте, чтобы свести на нет изменения в экспрессии белка во время обработки 33,34. На самом деле, на месте были разработаны для отбора проб и фиксации технологии, которые позволяют автономного сбора и сохранения образцов на корабле развернуты инстру.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность Маркосу Ди Фалько за его опыт и советы по подготовке образцов для нано-ЖК МС/МС, а также доктору Зорану Миничу из Университета Реджайны за анализ ЖХ МС/МС. Эта работа была поддержана финансированием NSERC (DG402214-2011) и CRC (950-221184). Округ Колумбия был поддержан Институтом воды, энергетики и устойчивых систем Concordia и FQRNT.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Sterivex -GP 0.22 μ m фильтрующий блок | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 или TB0196-500G | Экстракция белка/ SDS PAGE гель |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Экстракция белка |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Экстракция белка/ SDS PAGE гель |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Экстракция белка |
| Глицерин | Fisher Scientific | 56-81-5 | Экстракция белка |
| 10K Amicon Фильтр | Millipore | UFC801024 | Экстракция белка |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Преципитация белка |
| Ацетон | Fisher Scientific | 67-64-1 | Преципитация белка |
| MPC Реагент для осаждения белка | Epicenter | mmP03750 | Осаждение ДНК |
| 2-пропанол | Fisher Scientific | 67-63-0 | Осаждение ДНК |
| Набор для анализа Qubit dsDNA BR | Life Technologies | Q32850 | Набор для количественного определения ДНК |
| Набор для анализа белка | Life Technologies | Q33211 | Набор для количественного определения белка |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE гель |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE гель |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE гель |
| 30% Акриламид | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE гель |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE гель |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE гель |
| B-меркаптоэтанол | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE гель |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE гель |
| Precision Plus Protein Калейдоскоп Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE гель |
| Ацетонитрил | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Трипсин дайджест |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Муравьиная кислота | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| ВЭЖХ класса H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1,5 мл | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 мл ROBO флакон 9 мм | Candian Life Science | VT009/C395SB | В-гелевый дайджест трипсина |
| Вкладыш из полипропилена BM, без пружины | Candian Life Science | 4025P-631 | В геле Трипсин дайджест |
Ссылки
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasona....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
