Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Resumen

Este protocolo es para la extracción y concentración de proteínas y ADN de la biomasa microbiana recogida del agua de mar, seguida de la generación de péptidos trípticos adecuados para el análisis proteómico basado en espectrometría de masas en tándem.

Resumen

Las tecnologías metaómicas como la metagenómica, la metatranscriptómica y la metaproteómica pueden ayudar en la comprensión de la estructura y el metabolismo de la comunidad microbiana. Aunque poderosa, la metagenómica por sí sola solo puede dilucidar el potencial funcional. Por otro lado, la metaproteómica permite describir el metabolismo y la función de una comunidad expresados in situ. Aquí describimos un protocolo para la lisis celular, el aislamiento de proteínas y ADN, así como la digestión y extracción de péptidos de células microbianas marinas recolectadas en una unidad de filtro de cartucho (como la unidad de filtro Sterivetx) y conservadas en una solución de estabilización de ARN (como RNAlater). En los estudios proteómicos basados en espectrometría de masas, la identificación de péptidos y proteínas se realiza comparando espectros de masas en tándem de péptidos con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas. Incluir el metagenoma de una muestra en la base de datos de búsqueda aumenta el número de péptidos y proteínas que se pueden identificar a partir de los espectros de masas. Por lo tanto, en este protocolo se aísla el ADN del mismo filtro, que se puede utilizar posteriormente para el análisis metagenómico.

Introducción

Los microorganismos son ubicuos y juegan un papel esencial en los ciclos biogeoquímicos de la Tierra ^1. Actualmente, existen numerosos enfoques moleculares disponibles para la caracterización de estructura de la comunidad microbiana y función. El más común es el análisis de secuencias de genes de ARNr 16S amplificó por PCR a partir de ADN ambiental ^{2 - 4 de.} Una desventaja de análisis de genes 16S rRNA es que sólo proporciona información sobre la identidad filogenética y estructura de la comunidad, con poca información sobre la función metabólica. En contraste, los enfoques tales como la metagenómica, metatranscriptomics y metaproteomics proporc....

Protocolo

1. Prepare Reactivos

1. Preparar la solución de SDS-extracción: M Tris-HCl pH 0,1 7,5, 5% de glicerol, EDTA 10 mM y 1% de SDS. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
2. Preparar reactivos de valores necesarios para el gel de poliacrilamida.
   1. Preparar 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente.
   2. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente.
   3. Preparar 10% de SDS. Filtrar esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente.
   <....

Resultados

Como demostración, se realizó el protocolo en dos muestras de agua de mar recogidas de la superficie y el máximo de clorofila del océano costero en el norte de Canadá. Mientras que en el mar, 6-7 de L de agua de mar se pasó a través de un GF / D prefiltro 3 micras, a continuación, se recogieron las células microbianas en una unidad de filtro de cartucho de 0,22 micras siguiendo el protocolo de Walsh et al. ^20. Las células se almacenan inmediatamente en una solución de estabilización de ARN hasta su p.......

Discusión

La preservación de la muestra es clave para estudios metaproteomic y el trabajo previo demostró que una solución de estabilización de ARN es un tampón de almacenamiento útil para almacenar las células antes de la extracción de proteínas ^28. Idealmente, las muestras se conservan in situ para negar los cambios en la expresión de la proteína durante la manipulación ^33,34. De hecho, in situ se han desarrollado tecnologías de muestreo y fijación, que permiten la colección autónomo y co.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sterivex -GP 0.22 μ m unidad de filtro	Millipore	SVGP01050	Muestreo
RNAlater Solución de estabilización	Ambion	AM7021	Muestreo
Tris	Bio Basic	77-86-1 o TB0196-500G	Extracción de proteínas/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Extracción de proteínas
SDS	Bio Basic	15-21-3	Extracción de proteínas/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Extracción de proteínas
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Extracción
de proteínas10K Filtro Amicon	Millipore	UFC801024	Extracción de proteínas
Metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Precipitación de proteínas
Acetona	Fisher Scientific	67-64-1	Precipitación de proteínas
MPC Reactivo de precipitación de proteínas	Epicentro	mmP03750	Precipitación
de ADN 2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	Precipitación de ADN
Kit de ensayo Qubit dsDNA BR	Life Technologies	Q32850	Cuantificación de ADN
Kit de ensayo de proteínas Qubit	Life Technologies	Q33211	Cuantificación de proteínas
Sacarosa	Bio Basic	57-50-1	GEL SDS
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrilamida	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoetanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Escalera Caleidoscopio	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrilo	VWR	CABDH6044-4	In-gel Tripsina digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Digestión de tripsina
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Digestión de tripsina
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Digestión
Grado HPLC H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	Digestión de tripsina en gel
Yodoacetamida	Bio Basic	144-48-9	Digestión en gel de tripsina Tripsina
	Promega	V5111	En gel Digestión de tripsina
Protein LoBind Tubo 1,5 ml	Eppendorf	22431081	en gel Digestión de tripsina
2 ml Vial ROBO 9 mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	Digestión de tripsina en gel
Inserto PP BM, sin muelle	Candian Life Science	4025P-631	Digestión de tripsina en gel

PAGE de tripsina