Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

Özet

Bu protokol, deniz suyundan toplanan mikrobiyal biyokütleden protein ve DNA'nın ekstraksiyonu ve konsantrasyonu ve ardından tandem kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz için uygun triptik peptitlerin üretilmesi içindir.

Özet

Metagenomik, metatranskriptomik ve metaproteomik gibi meta-omik teknolojiler, mikrobiyal topluluk yapısı ve metabolizmasının anlaşılmasına yardımcı olabilir. Her ne kadar güçlü olsa da, metagenomik tek başına sadece fonksiyonel potansiyeli aydınlatabilir. Öte yandan, metaproteomik, bir topluluğun ifade edilen in situ metabolizmasının ve işlevinin tanımlanmasını sağlar. Burada, hücre lizisi, protein ve DNA izolasyonunun yanı sıra bir kartuş filtre ünitesinde (Sterivex filtre ünitesi gibi) toplanan ve bir RNA stabilizasyon solüsyonunda (RNAlater gibi) korunan deniz mikrobiyal hücrelerinden peptit sindirimi ve ekstraksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik çalışmalarda, peptitlerin ve proteinlerin tanımlanması, peptit tandem kütle spektrumlarının çevrilmiş nükleotid dizilerinin bir veri tabanı ile karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Bir numunenin metagenomunu arama veritabanına dahil etmek, kütle spektrumlarından tanımlanabilen peptit ve protein sayısını artırır. Bu nedenle, bu protokolde DNA, daha sonra metagenomik analiz için kullanılabilen aynı filtreden izole edilir.

Giriş

Mikroorganizmalar her yerde ve Dünya'nın biyokimyasal döngüler ¹ temel rol oynamaktadır. Şu anda, mikrobiyal topluluk yapısını ve işlevini tanımlamak için kullanılabilir birçok moleküler yaklaşımlar vardır. ^{4 - En yaygın} 16S rRNA geninin analizi, çevre DNA ² PCR ile amplifiye dizileri. 16S rRNA gen analizi bir dezavantajı sadece bir metabolik fonksiyonu ile ilgili çok az bilgi, filogenetik kimlik ve toplum yapısı hakkında bilgi temin etmesidir. Metagenomik, metatranscriptomics ve metaproteomics toplum yapısı ve metabolizma hakkında bilgi vermek olarak tersine, bu tür yaklaşımları. ^{8 -} Metagenomiks veya organizmaların bi....

Protokol

1. Reaktifler hazırlayın

1. SDS-ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın: 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 5% gliserol, 10 mM EDTA ve% 1 SDS. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
2. Poliakrilamid jeli için ihtiyaç duyulan Stok reaktifleri hazırlayın.
   1. 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 hazırlanır. Oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
   2. 0.5 M Tris-HCL pH 6.8. Oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
   3. % 10 SDS hazırlayın. Filtre, oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak sterilize edin.
3. -Jel tripsin sindirimi ve peptit ç....

Sonuçlar

Bir gösteri olarak, yüzey ve Kuzey Kanada'da kıyı okyanus klorofil maksimum toplanan iki deniz suyu örnekleri üzerinde protokol uygulandı. Denizde, deniz suyu 6-7 L 3 mikron GF / D ön filtre geçirildi ederken, daha sonra mikrobiyal hücrelerin Walsh ve ark., ²⁰ protokole 0.22 mikron kartuş filtre ünitesi üzerine toplanmıştır. Hücreler, hemen daha sonra işlenene kadar bir RNA stabilizasyonu çözelti içinde muhafaza edilmiştir. Burada sunulan laboratuarda döndükten sonra biz protokol uygulandı. Konsa.......

Tartışma

Örnek korunması metaproteomic çalışmalara anahtarıdır ve önceki iş bir RNA stabilizasyonu çözümü öncesinde protein ekstraksiyon ²⁸ hücreleri saklamak için kullanışlı bir depolama tampon olduğunu göstermiştir. İdeal olarak, numuneler ^33,34 taşıma sırasında protein ifadesindeki vardiya inkâr yerinde korunmuş olacaktır. Aslında, yerinde numune alma ve sabitleme teknolojileri gemi dağıtılan araçlarla özerk toplama ve numunelerin saklanması için izin veren, geliştirilmiştir. Ancak, bu .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sterivex -GP 0.22 & mu; m filtre ünitesi	Millipore SVGP01050		Numune Alma
RNAlater Stabilizasyon Solüsyonu	Ambion	AM7021	Numune Alma Tris
	Bio Basic	77-86-1 veya TB0196-500G	Protein Ekstraksiyonu / SDS PAGE jel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Ekstraksiyonu
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Ekstraksiyonu / SDS PAGE jel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Ekstraksiyonu
Gliserol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Ekstraksiyonu
10K Amikonto	Filtre Milipore UFC801024		Protein Ekstraksiyonu
Metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Çökeltme
Aseton	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Çökeltme
MPC Protein Çökeltme reaktifi	Merkez üssü	mmP03750	DNA Çökeltme
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Çökeltme
Qubit dsDNA BR Test kiti	Yaşam Teknolojileri	Q32850	DNA Miktar Tayini
Qubit Protein Test kiti	Yaşam Teknolojileri	Q33211	Protein Miktar Tayini
Sükroz	Bio Basic	57-50-1	SDS SAYFASI jel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE jel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE jel
%30 Akrilamid	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE jel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE jel
Glisin	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE jel
B-merkaptoetanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE jel
Laemmli Numune Tamponu	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE jel
Precision Plus Protein Kaleydoskop Merdiven	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE jel
Asetonitril	VWR	CABDH6044-4	Jel İçi Tripsin sindirim
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	Jel İçi Tripsin sindirimi
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Jel İçi Tripsin sindirimi
Formik Asit	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	Jel İçi Tripsin sindirimi
HPLC sınıfı H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	Jel İçi Tripsin sindirimi
İyodoasetamid	Bio Basic	144-48-9	Jel İçi Tripsin sindirimi
Tripsin	Promega	V5111	Jel İçi Tripsin sindirimi
Protein LoBind Tüpü 1.5 ml	Eppendorf	22431081	Jel İçi Tripsin digest
2 ml ROBO flakon 9 mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	Jel içi Tripsin digest
PP BM uç, Yay yok	Candian Yaşam Bilimleri	4025P-631	Jel İçi Tripsin sindirimi