マウスにおけるFeCl3誘発血栓症モデルは、ここで説明されています。腸間膜血管の生体内顕微鏡観察と頸動脈の血流測定により血栓の成長を監視する方法が提示されます。
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この記事について
サマリー
要約
重度の血栓症とその虚血性結果、例えば心筋梗塞、肺塞栓症、脳卒中などは、世界的な主要な健康問題です。塩化第二鉄損傷は、露出した静脈または小径および大径の動脈における血栓の形成を迅速かつ正確に誘発するための確立された技術です。このモデルは、血栓症の病態生理学の研究、新規抗血栓薬の発見と検証、およびこれらの新薬剤の作用機序の理解において重要な役割を果たしてきました。ここでは、マウスの腸間膜血管および頸動脈に対するこの技術の実施について紹介します。この方法は、循環する白血球と血小板を蛍光色素で標識し、露出した腸間膜の生体内顕微鏡検査により、血栓の形成につながる損傷した血管壁でのそれらの蓄積を観察する方法を説明しています。頸動脈では、血栓形成による閉塞をドップラープローブで血流をモニタリングすることで測定します。
概要
血栓症および抗血栓薬の有効性の評価の開発に関与するメカニズムの研究は、十分に実験動物モデルを確立が必要です。大型動物モデルは、それらが齧歯類1よりヒトに類似大型船を提供するように使用される最初でした。しかし、高コストは、必要な大きな施設とそれらを操作する上での困難は、遺伝的にそれらの使用に大きな欠点であり、げっ歯類の予備試験は決定的な結果を2与えた後に大型動物は、現在後期前臨床研究に制限されています。トランスジェニックおよびノックアウト株の広い可用性とインビボ試験のために必要な抗血栓薬の量を最小限に抑え、その小さなサイズで、マウスは主に血栓症の研究のために使用されています。したがって、血栓障害のいくつかのモデルは、マウス3で開発されてきました。
多くの確立された血栓症モデルがintimを混乱させる血栓4の形成を誘導する血流のサブ内皮細胞外マトリックスの暴露に続いて、血管壁の層。血栓は/及び凝固カスケード5を活性化する組織因子の曝露または血小板の活性化を引き起こすコラーゲンの曝露から生じ得ます。いくつかの技術が、初期血管損傷を達成するために使用されます。 Pierangeli らは大腿静脈6のマイクロサージェリーツールを使用して機械的破壊モデルを開発しました。 Kikushi ら緑色光（540 ....
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プロトコル
動物に関わるすべての実験はアルフレッド医学研究および教育分署動物倫理委員会（E / 2015分の1534 / B）によって承認されました。すべての外科的操作は、全身麻酔下で行われ、動物がどの段階でも痛みを経験しませんでした。記載されている全ての実験は、非回復しています。
1.準備
- フィルターペーパー（1ミリメートル×2ミリメートル）の薄いバンドをカットします。
- 新たに4％の塩化第二鉄の2つの溶液を調製し（w / v）の6％（W / V）の脱イオン水に希釈しました。 0.22μmのを介して濾過し、PBS中のローダミン6G液0.3％を、準備します。
- シリンジラッパーの白いプラスチックの小片（5ミリメートル×1センチ）カット。
生体顕微鏡で観測された2腸間膜細動脈の血栓形成
- 10-12週齢の雄のC57BL / 6野生型マウスを秤量し、腹腔内注射しかしケタミンの混合物（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で麻酔に応じ。つま先、尾および/または皮膚のピンチに反応し、角膜および眼瞼ピンチからの反応性、およびウィスカの動きが存在しないことによって麻酔の深さを監視します。必要に応じて、動物の麻酔を維持するために、ケタミンの第二の用量（50mg / kg）を注入します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。....
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結果
ローダミン6Gの蓄積を明らかにする腸間膜の蛍光生体顕微鏡観察は、FeCl 3をすることによって損傷した血管壁に沿って、血小板と白血球を標識しました。部分的な血栓形成の進行は200ミクロンの腸間膜血管（ 図1）でモニタされます。血栓がゆっくりと表示され、FeCl 3をへの暴露の最初の分（ 図1、tは60秒=）の後に明らかに識別可能です。 40秒のFeCl 3に浸したろ紙を除去した後、血栓症が急速に進行し、最終的に（ 図1、T = 100秒）観察容器全体のセクションの壁上に存在します。
図1：血栓の成長は、腸間膜血管に蛍光生体顕微鏡で観測された画像は15秒で撮影した.......
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ディスカッション
塩化第二鉄誘発される血栓症モデルは、優れた研究ツールです。この研究で示されるように、実装が非常に容易であり、生体顕微鏡またはドップラー流量計と組み合わせて使用する場合には、血栓形成の良好なリアルタイムモニタリングを提供します。長時間露光とのFeCl 3の濃度を調整する、それはまた、非閉塞または閉塞のいずれか血栓を生成する可能性を提供しています。
しかし、この方法はまた、いくつかの制限を有します。頸動脈において、主な欠点は、閉塞時間を効果的に修正することができるが、モデルの再現性を正確に血栓サイズおよび成長速度10を制御するために、あまりにも弱いままであることです。いくつかのグループは、モデル28,29の標準化に取り組んできました。オーエンスら 。信頼性と再現性の閉塞時間は、実際に、そのような年齢のようなすべての変動要因を減少させることによって得ることができることを示唆しマウス、マウスの遺伝的背景、利用麻酔、塩化第二鉄の博覧会のための技術および塩化第二鉄溶液28の濃度。ドップ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、技術的な喜びヤオ博士カレンアルトからのサポートだけでなく、NHMRCとNHFからの資金を承認したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Whatman クロマトグラフィー ペーパー | GE Healthcare | 3030917 | |
| 塩化鉄 (III) 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| ローダミン 6G | シグマ | R4127 | |
| 倒立顕微鏡 | オリンパス | IX81 | |
| デジタル白黒カメラ | オリンパス | XM10 | |
| ドップラー流量計 | Transonic | TS420 | |
| ナノドップラーフロープローブ | Transonic | 0.5 PBS | |
| ケタミン | ホスピラ | 0409-2051-05 | |
| キシラジン(ランプン) | バイエル | 75313 | |
| ペトリ皿 | Sarstedt | 82.1472 | |
| インスリン注射器 (29 G) | BD 超微細 | 326103 | |
| 綿チップ アプリケーター | BSN 医療 | 211827A | |
| Dynek dysilk 縫合糸 | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco のリン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| 加熱パッド | Kirchner | T60 |
参考文献
- Leadley, R. J., Chi, L., Rebello, S. S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. J Pharmacol Toxicol Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Johnson, G. J., Griggs, T. R., Badimon, L.
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